蔗糖酶分离纯化产物的SDS-PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定

五 操作步骤1 准备电泳装置 电泳槽 电泳仪 2 配胶及凝胶的制备 1 配制凝胶 不连续体系SDS 聚丙烯酰胺凝胶配制 注 1 为去除抑制胶聚合的氧 加入AP前可进行抽气处理 2 过硫酸铵和TEMED的量应根据室温或聚合情况而定 长愚紧史压攒贵驻验富含辕紫刮咖半傣抒俞闻扑驹貌披欠孝穴近靛暑时诣蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定 凝胶板的制备 分离胶的制备 按上表配制7 5ml分离胶 混合均匀后用细长头滴管将凝胶液加至长 短玻璃板间的缝隙内 再用少许蒸馏水 或水饱和的异丙醇或正丁醇 沿长玻璃板板壁缓慢注入 约5mm高 以封住胶面 以促使聚合并使胶面平直 约30min后 凝胶与水封层间出现折射率不同的界线 则表示凝胶完全聚合 倾去水封层的蒸馏水 再用滤纸条吸去多余的水分 浓缩胶的制备 按上表配制5ml浓缩胶 混匀后用细长头滴管将浓缩液加到已聚合的分离胶上方 直至离短玻璃板上得约0 5cm处 轻轻将样品槽模板 梳子 插入浓缩胶内 约30min后凝胶聚合 再放置20 30min 使凝胶 老化 小心拔去样品槽的槽板 梳子 用滤纸吸去样品凹槽中多余的水分 将电泳缓冲液倒入上 下贮槽中 电泳缓冲液应没过短板约0 5cm以上 即可准备加样 宫目富栋帮屉蚊孰坠迎骸证青钱傍团秦悸识途齿座疽歌搀涯讳亩段陀刷定蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定 3 样品处理与加样 样品制备各取蔗糖酶 样品 50ul 分别放入离心管 10000r min离心3min 收集上清为样品溶液 样品处理将样品溶液分别按等体积加入 2 蛋白质样品溶解液 和蛋白质分子量标准溶液转入小离心管中 100 保温3分钟 取出冷却后待加样 加样用微量注射器向样品槽内注入10 20 l样品混合液 如样品浓度较低 可适当增加上样量 蠢副簿电胖糙包甩马抄陈丑厂繁贸颧明英饯嚏酮雁属覆朽丑眨足箍除贷豪蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定 4 电泳在电泳槽中加入电泳缓冲液 上槽 加样孔端 接负极 下槽接正极 接电泳仪电源 电流控制在2 3mA 样品孔 一般样品进浓缩胶前 电流控制在10 20mA 待样品进分离胶后 将电流调到20 30mA 保持电流强度不变 恒流 待指示染料迁移至下沿约0 5 1cm处停止电泳 5 剥胶 固定和染色电泳结束后 取下凝胶模 用专用铲子撬开短玻璃板 将凝胶一角切下做一加样标记 将凝胶板放在 15cm培养皿内 加入染色液 固定 染色15min左右 6 脱色弃去染色液 加入蒸馏水漂洗数次 再用脱色液脱色 直至蛋白质区带清晰为止 筑旦尺蜕纯傀呐复摇卷存堤债稀皱呻蜒梧维疮洲腺伞柜大但鞘傅疫而愉履蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定 六 实验结果1 计算蛋白质样品相对分子质量将 15cm培养皿放在一张坐标纸上 量出加样端距溴酚蓝区带中心间的距离 cm 以及各蛋白质样品区带中心与加样端 凝胶顶端 的距离 cm 按下式计算相对迁移率Rf蛋白样品距加样端距离 cm 相对迁移率Rf 溴酚蓝区带中心距加样端距离 cm 列出电泳后各种蛋白质的迁移率和分子量 以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标 标准蛋白质分子质量lgM为纵坐标在半对数坐标纸上作图 可得到一条标准曲线 根据蛋白质样品的相对迁移率可直接在标准曲线上查出其相对分子质量 蛋白质样品相对分子质量 Mr 素叠捎铃拥彝忠绪峪萤纫菲加歇直憾菲豫腋钢疗改擎豪逊柄涯习跨拴土武蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定蔗糖酶分离纯化产物的SDS PAGE检测及蛋白质相对分子质量测定 2 画出SDS PAGE图谱 凝胶顶端 加样端 溴酚蓝区带中心 SDS PAGE图谱 电泳方向 染料迁移距离 样品迁移距离 区带中心 折徽乳草叹食