H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建.ppt

H5N1亚型禽流感病毒感染性克隆的构建及其RNA干扰的研究 汇报提纲 文献综述RNA干扰对A型流感病毒基因表达及病毒复制的抑制作用的研究H5N1亚型禽流感病毒A chicken Hubei 327 2004全基因组克隆 测序及其感染性克隆的构建 1文献综述 文献综述 禽流感的发生与流行 文献综述 禽流感 AvianInfluenza AI 是由A型流感病毒引起的一种禽类的烈性传染性疾病或疾病综合征 1878年 首次在意大利发现了禽流感的流行 高致病性禽流感 HighlyPathogenicAvianInfluenza HPAI 是由A型流感病毒中H5 H7亚型流感病毒引起 目前已经呈世界性分布 全世界50多个国家和地区 OIE数据 报道了高致病性禽流感的发生和流行 我国自1996年首次报道分离到H5N1亚型高致病性禽流感病毒之后 其流行一直呈上升趋势 世界上高致病性禽流感感染人的发病与死亡情况 截至2006 6 03 文献综述 禽流感病毒的结构模式图 文献综述 流感病毒为单股负链RNA 由8个片断组成 共编码8种结构蛋白和2种非结构蛋白 其表面有一层由双层脂质构成的囊膜 镶嵌着二种重要的纤突 分别为HA NA 病毒粒子的主要蛋白成分 血凝素 HA 神经氨酸 NA 核蛋白 NP 基质蛋白 M1 M2 聚合酶 PB1 PB2 PA 非结构蛋白 NS1 NS2 RNA干扰的基本原理 文献综述 ATP RNA解旋酶 通过作用于病毒特定基因的siRNA抑制病毒在细胞内的复制 siRNA可作用于细胞中病毒靶受体以干扰病毒的侵染 期望达到治疗病毒性疾病的目标 RNA干扰技术已经在多种病毒研究中得到了成功的应用 人类免疫缺陷病毒 型 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 甲型流感病毒 口蹄疫病毒 西尼罗病毒和SARS冠状病毒等 RNAi在病毒研究中的应用 文献综述 病毒的感染性克隆其实就是模拟病毒复制 转录等病毒生命周期 人工构建病毒的过程 病毒的感染性克隆也称为病毒的反向遗传操作技术 ReverseGeneticManipulaton 病毒的感染性克隆 文献综述 反向遗传学及其操作技术 反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象 与之相关的各种技术统称为反向遗传学操作技术 病毒反向遗传操作技术解决了对RNA病毒基因组难以操作这一困扰研究者多年的难题 开创了病毒研究的新时代 文献综述 禽流感病毒的复制 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统核糖核蛋白转染法RNA聚合酶 方法完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统RNA聚合酶 系统 17质粒系统RNA聚合酶 系统 12质粒系统双向RNA聚合酶 转录系统 8质粒系统 流感病毒反向遗传操作技术的发展历程 以辅助流感病毒为基础的反向遗传操作系统 核糖核蛋白转染法 采用T7RNA聚合酶体外转录系统 NS CAT NS 体外转录RNA聚合酶 方法 RNA聚合酶I polI 启动子代替T7RNA聚合酶启动子 完全以克隆的cDNA为基础的反向遗传操作系统 17质粒系统 12质粒系统 2000年 Hoffmann等建立了RNA聚合酶 系统 vRNA和mRNA的合成来自于一个模板 不需要构建专门的蛋白表达质粒 为拯救病毒而构建的质粒数将大大减少 这一系统采用共培养的293T细胞和MDCK细胞 8质粒转染细胞后 RNA聚合酶 转录产生负链vRNA RNA聚合酶 合成正链mRNA 转染的293T细胞中产生的病毒随后将感染MDCK细胞并大量复制 RNA聚合酶 转录系统 8质粒系统 RNA聚合酶 转录系统 8质粒系统 双向RNA聚合酶 转录系统 8质粒系统 利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的致病性利用反向遗传学操作技术研究流感病毒的生命周期利用反向遗传学操作技术研究流感疫苗 流感病毒反向遗传操作技术的应用 6 2 流感疫苗 2RNA干扰对A型流感病毒基因表达及病毒复制的抑制作用的研究 2 1研究目的和意义 本研究选用NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因 针对NP和M2基因保守区段设计了5对siRNA 研究了siRNA对基因表达的影响及其对H1N1 H5N1和H9N2亚型流感病毒在体内和体外复制的影响 筛选出能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列 为探索RNAi技术应用于抗禽流感研究奠定基础 研究目的和意义 2 2研究内容 禽流感病毒A chicken Hubei 327 2004NP和M2基因的克隆及M2基因跨膜区的缺失 M2 NP和 M2基因同eGFP共表达真核质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达 NP和 M2基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建siRNA对NP和 M2基因在HeLa细胞中表达水平影响的研究 siRNA在体外 MDCK细胞上 对流感病毒 H5N1 H9N2 H1N1 复制的影响 siRNA的体内试验和攻毒保护试验 研究内容 2 3结果与分析 NP基因的PCR扩增及同报告基因 EGFP 融合表达质粒的构建 结果与分析 NP基因的PCR扩增结果 质粒pCDM NP的酶切鉴定和PCR鉴定 PCR方法缺失M2基因跨膜区 结果与分析 M2基因的克隆 跨膜区的缺失及同报告基因 EGFP 融合表达质粒的构建 结果与分析 M2基因跨膜区缺失的PCR扩增结果 质粒pCDM M2的酶切鉴定和PCR鉴定 结果与分析 NP基因同EGFP在HeLa细胞中的融合表达 M2基因同EGFP在HeLa细胞中的融合表达 质粒pCDM NP pCDM M2在转染HeLa细胞后12小时就可以检测到特异性荧光 转染后24小时发出荧光的细胞明显增多 荧光主要呈弥散性分布于整个细胞中 说明NP基因与EGFP M2基因与EGFP均发生了融合表达 NP M2基因同报告基因 EGFP 在HeLa细胞中的融合表达 NP和 M2基因特异性siRNA的设计及其真核表达质粒的构建 BamHI HindIII 结果与分析 NP和 M2基因特异性siRNA真核表达质粒的构建 siRNA表达质粒bamHI HindIII的双酶切鉴定M DNAmarker DL 15000 1 pSCMV M482 pSCMV M7543 pSCMV M9494 pSCMV NP7495 pSCMV NP1383 结果与分析 结果与分析 siRNA表达质粒与pCDM NP共转染 siRNA表达质粒与pCDM M2共转染 siRNA表达质粒与pCDM NP或pCDM M2共转染 siRNA对NP和 M2基因在HeLa细胞中表达水平影响 结果与分析 siRNA表达质粒同pCDM NP共转染后24h的流式细胞检测 结果与分析 结果与分析 siRNA表达质粒同pCDM M2共转染后24h的流式细胞检测 半定量RT PCR检测NP EGFPmRNA的水平 结果与分析 A pNP EGFP pS NegativeB pNP EGFP pS NP749C pNP EGFP pS NP1383D CellControl 结果与分析 A p M2 EGFP pS NegativeB p M2 EGFP pS M48C p M2 EGFP pS M754D p M2 EGFP pS M949E CellControl 半定量RT PCR检测 M2 EGFPmRNA的水平 半定量RT PCR检测看家基因GAPDHmRNA的水平 结果与分析 A pCDM NP pSilencer4 1 negativeB pCDM NP pSCMV NP749C pCDM NP pSCMV NP1383D pCDM M2 pSilencer4 1 negativeE pCDM M2 pSCMV M48F pCDM M2 pSCMV M754G pCDM M2 pSCMV M949H CellControl Westernblot评价siRNA对目的基因表达的抑制作用 结果与分析 Westernblot检测 M2基因的表达水平A pCDM M2 pSilencer4 1 negativeC pCDM M2 pSCMV M754B pCDM M2 pSCMV M949D pCDM M2 pSCMV M48E CellControl Westernblot检测NP基因的表达水平A pCDM NP pSilencer4 1 negativeC pCDM NP pSCMV NP1383B pCDM NP pSCMV NP749D CellControl Westernblot检测GAPDH基因的表达 结果与分析 A pCDM NP pSilencer4 1 negativeE pCDM M2 pSCMV M48B pCDM NP pSCMV NP749F pCDM M2 pSCMV M754C pCDM NP pSCMV NP1383G pCDM M2 pSCMV M949D pCDM M2 pSilencer4 1 negativeH CellControl siRNA对A型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用 结果与分析 在6孔板上培养MDCK细胞 待细胞长至80 满时分别转染siRNA表达质粒 同时设置pSilencer4 1 negative对照和空白细胞对照 转染后18 24h分别接种流感病毒H1N1 106TCID50 H5N1 104TCID50 H9N2 106TCID50 接毒后48 72h收获细胞及上清进行病毒TCID50的测定 siRNA对A型流感病毒在MDCK细胞中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA对A型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 各攻毒组小鼠 4只 组 注射质粒的种类和剂量 siRNA对H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA的瞬时表达特异性抑制H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制 siRNA对H5N1亚型禽流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA特异性抑制H5N1流感病毒在体内的复制 siRNA对H1N1和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA的瞬时表达特异性抑制H1N1亚型流感病毒在小鼠肺脏中的复制 siRNA的瞬时表达特异性抑制H9N2亚型禽流感病毒在小鼠肺脏中的复制 siRNA对H1N1和H9N2亚型流感病毒在小鼠肺中复制的抑制作用 结果与分析 siRNA显著性降低H1 H5和H9亚型流感病毒攻击小鼠的肺病毒滴度 siRNA对A型流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析 攻毒保护组小鼠 8只 组 注射质粒的种类和剂量 siRNA对H1N1亚型流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析 H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化 Groupsdifferforweightloss p 0 05 Student stest H1N1亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率 siRNA对H5N1亚型禽流感病毒攻击小鼠的保护作用 结果与分析 H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠体重的变化 Groupsdifferforweightloss p 0 05 Student stest H5N1亚型流感病毒攻击后小鼠的存活率 2 4讨论 讨论 RNAi的设计 RNAi具有高度的基因特异性 在发夹式siRNA中 单个碱基的错配都可能会消除它的RNAi效果 因此 构建的siRNA表达质粒必须经过测序鉴定 保证与靶基因的100 同源性 所设计的siRNA序列不应与人或其它动物基因组同源 本研究中 看家基因 GAPDH的检测结果显示 所选择的siRNA没有干扰转染细胞本身的基因表达和转录 讨论 NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因的意义 NP和M2基因是A型流感病毒中最保守的基因 变异很小 因而选择NP和M2基因作为RNA干扰的靶基因 这样找到的能有效抑制流感病毒复制的siRNA序列对所有A型流感病毒都是有效的 本研究的结果也显示了 能有效抑制NP和M2基因转录和表达的siRNA对A型流感病毒中不同亚型的病毒均有抑制作用 说明以NP和M2为靶基因设计的siRNA对A型流感病毒的抑制作用具有广谱性 讨论 RNA干扰在抗病毒研究中的应用前景 依靠RNAi技术获得病毒复制的强有效抑制的同时 不得不考虑病毒逃逸的可能性 为避免这个困难 通常采用多个必需靶位点作为联合siRNA治疗方法 以避免病毒逃逸突变株的演化 本研究中采用siRNAM 48 NP 1383联合使用时的效果明显优于二者单独使用时的效果 这可能也是因为联合使用时针对的是流感病毒的两个基因的靶位点 从而有效地减少了病毒逃逸的可能 增强了治疗效果 讨论 2 5结论 完成了禽流感病毒A chicken Hubei 327 2004NP和M2基因的克隆 采用PCR方法缺失了M2基因跨膜区的第26 55位氨基酸 M2 实现了NP和 M2基因分别同EGFP在HeLa细胞中的融合表达 融合蛋白呈弥散性分布于细胞浆中 以NP和 M2基因为靶序列 设计合成了五个siRNA 并构建了各自的表达质粒 将siRNA表达质粒分别与对应的pCDM NP和pCDM M2共转染HeLa细胞后 通过荧光观察 流式细胞 半定量RT PCR和Westernblot等方法检测证实 针对NP基因设计的2个siRNA均对NP基因的转录和表达产生了显著的抑制作用 针对 M2基因设计的3个siRNA也均对 M2基因的转录和表达产生了显著的抑制作用 2 5结论 设计的siRNA抑制流感病毒 H5N1 H9N2 H1N1 在MDCK细胞上的复制 其中pSCMV M48和pSCMV NP1383对流感病毒复制的抑制作用最强 设计的siRNA导入小鼠体内能有效降低H5N1 H9N2 H1N1流感病毒感染小鼠的肺病毒滴度 pSCMV M48和pSCMV NP1383联合使用时 攻毒小鼠体重减轻幅度较对照组小 且能部分保护小鼠遭受致死性流感病毒的攻击 3H5N1亚型禽流感病毒A chicken Hubei 327 2004全基因组克隆 测序及其感染性克隆的构建 3 1研究目的和意义 本研究针对2004年春禽流感爆发流行期间在湖北省家禽感染病料中分离出的一株H5N1禽流感病毒 对其全基因组进行克隆 测序及遗传进化分析 根据基因核苷酸序列绘制出了H5N1亚型禽流感病毒基因组系统发育进化树 目的是揭示H5N1禽流感病毒湖北分离株与其它流感病毒流行株间的亲缘关系及遗传演化规律 为高致病性禽流感的预测 监控 防制提供有力的证据 研究目的和意义 反向遗传操作技术发展到现在 实现了使用完全以质粒为基础的操作系统 因此可以对病毒基因组方便地操作 显示了良好的应用前景 病毒的反向遗传操作技术在深入阐明病毒的生活周期和致病性 基因组的结构与功能 研制基因修饰的疫苗候选株 发展病毒载体等方面可以广泛地应用 研究目的和意义 3 2研究内容 H5N1亚型禽流感病毒A chicken Hubei 327 2004全基因组克隆 测序及遗传进化分析用于流感病毒拯救的八个转染用质粒的构建H5N1亚型禽流感病毒湖北分离株的体外拯救拯救病毒的鉴定 研究内容 3 3结果与分析 基因组八个片段的PCR扩增结果 H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析 H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析 H5N1亚型禽流感病毒基因序列及遗传进化分析 全基因组的亚克隆及八质粒转染系统的构建 BsmBI BsaI 流感病毒的拯救 SPF鸡胚增殖 拯救病毒在SPF鸡胚中增殖不同代次的血凝价 结果与分析 1 5 TheNO 1generationvirustiters2 6 TheNO 2generationvirustiters3 7 TheNO 3generationvirustiters4 8 Negativecontrol 获救病毒和野毒对MDCK细胞病变的比较 结果与分析 原始野毒在MDCK细胞上形成的病变 拯救病毒在MDCK细胞上形成的病变 正常的MDCK细胞对照 RT PCR扩增鉴定拯救病毒 结果与分析 1DNAmarker DL15000 2RT PCRproductofPB2gene3RT PCRproductofPB1gene4RT PCRproductofPAgene5RT PCRproductofHAgene6RT PCRproductofNPgene7RT PCRproductofNAgene8RT PCRproductofMgene9RT PCRproductofNSgene 拯救病毒的电镜观察结果 结果与分析 A 放大倍数为10万倍B 放大倍数为20万倍C 放大倍数为80万倍Note 病毒呈圆形或椭圆形 直径在100nm左右 病毒有囊膜 且病毒表面呈现出明显的冠状结构 具有典型的流感病毒的形态特征 电镜观察结果证实了流感病毒的拯救 3 4讨论 讨论 八质粒拯救系统 八质粒系统大大减少了转染质粒数目 实现了在同一个载体上既控制vRNA的转录 也控制mRNA的合成 操作更加方便 效率更高 Hoffmann等 2000 在对人源流感病毒WSN进行拯救时 每毫升转染上清能产生8 107个的感染性病毒粒子 这样的效率在所有负链RNA病毒的拯救中都是最高的 由于质粒pHW2000的启动子是人源化 因而其用于禽源流感病毒的拯救效率就大大降低 因而 本试验完成的H5N1禽流感病毒的拯救就显得尤为不易 讨论 基因序列的准确性 获得准确可靠的cDNA序列是流感病毒拯救的前提 本研究使用高保真DNA聚合酶进行基因扩增 而每个阳性克隆送3 5个进行测序 并将测序结果同GenBank中收录的序列进行比较 从而确定一个序列比较可靠的阳性克隆 这些操作尽可能地减少了PCR引入的突变 这样所获得的cDNA克隆在序列上较为可靠 讨论 影响流感病毒拯救效率的因