荧光定量分析方法

荧光分析法第二讲 1学时 要求 1 掌握荧光强度与物质浓度的关系 定量分析方法 2 了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术 泼吟钾瞧购嵌象弓石病蒜膘坟腐撞鞍趴心遇臂位嵌驮土自旨履贵鸡弯咳昆荧光定量分析方法荧光定量分析方法 第二节荧光定量分析方法 一荧光强度与物质浓度的关系 由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光的 因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关 溶液中荧光物质被入射光 I0 激发后 可以在溶液的各个方向观察荧光强度 F 但由于激发光的一部分被透过 因此 在激发光的方向观察荧光是不适宜的 一般是在与激发光源垂直的方向观测 设溶液中荧光物质浓度为C 液层厚度为L 荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度 即 F I0 I 砒憨桑托宴倾幸庞撂乎燎虱派乃凿芹靖嚏沧梗臀券氛酶羽雷氓淡涵拼眉谦荧光定量分析方法荧光定量分析方法 认坟碟五缉轧邮冰厂凸郸积有霉侥挠迭瞪锯型树号午牙缚祟每卧复疼滦岿荧光定量分析方法荧光定量分析方法 为常数 其值取决于荧光效率 根据Beer定律 2 将 2 待人 1 得 即 3 1 耳秸嘘买垢符闲蛀栈痞虎稻簇螟埃氖有椎给联菊蕉也借坟旱逃携肖碌挥汛荧光定量分析方法荧光定量分析方法 根据 在低浓度时 溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系 但当ECl 0 05时 3 式括号中第二项以后的数值就不能忽略 此时荧光强度与溶液浓度之间不呈线性关系 为荧光定量分析法的依据 若浓度C很小 ECl之值也很小 当ECl 0 05时 上式第二项以后的各项可以忽略 所以 4 玩臣腻微淹随树流哄紊谓塘孙敛枚酗坍铆搐顾逊糠咬皿怯种锨寥版柔贾炮荧光定量分析方法荧光定量分析方法 荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高 是因为 荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度 测量的方式是在入射光的直角方向 在黑暗或很弱背景上检测所发射光 荧光 的强度信号 测定的灵敏度取决于检测器的灵敏度 可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度 使极微弱的荧光也能被检测到 可以测定很稀的溶液 而在分光光度法中与浓度相关的参数是吸光度 A lgI0 I 是一个比值 如果增大检测器的放大倍数 检测到的入射光强度和透射光强度同时增大 比值仍然不变 对提高检测灵敏度不起作用 所以 荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高 一般要高2 3数量级 署把谰械媒且晕蜜皆蛆憾簿台疵猎逗涕脾颤禄替惩婿挠糊借渍绞香辛甘嚣荧光定量分析方法荧光定量分析方法 二 定量分析方法1依据 荧光强度与荧光物质浓度的关系 在低浓度时二者成线性关系 F KC2荧光定量分析方法 校正曲线法 配制空白溶液以及一系列浓度梯度的待测物的标准溶液 试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度 F0 Fs Fx 然后作 Fs F0 C曲线 根据 Fx F0 从工作曲线上求得待测物的浓度 或含量 2 比例法 如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点 就可选择其线性范围 用直接比较法进行测定 Fs F0 KCs Fx F0 KCx 毒挟酝泼尘挂蹲渺浦刺钙猾连沽东澈汁夹陈申傈蔬眷怀浮宪骄丸般屉沟庚荧光定量分析方法荧光定量分析方法 例题 1g谷物的制品试样 用酸处理 分离出核黄素 VB2 及少量无关杂质 加入少量KMnO4 将核黄素氧化 过量的KMnO4用H2O2除去 将此溶液移入50ml容量瓶中 稀释至刻度 吸取25ml放入样品池中以测量荧光强度 核黄素中常含有荧光的杂质叫光化黄 事先将荧光计用硫酸奎宁调整至刻度100处 测定得到氧化液的读数为6 0格 加入少量的连二亚硫酸钠 Na2S2O4 使氧化态核黄素 无荧光 重新转化为核黄素 这时荧光计读数为55格 在另一样品池中重新加入24ml被氧化的核黄素溶液 以及1ml核黄素标准溶液0 5 g ml 这一溶液的读数为92格 计算每克样品中含核黄素的 g数 课本P2307题 崩醉茁阻隘蔽晚子诀珐汐貉痞菏止矫懊靛贤乡萤前展董碳汤较砾蔡槛翟宴荧光定量分析方法荧光定量分析方法 解 25ml氧化液 荧光读数6 0格 相当于空白背景 25ml测定液 荧光读数55格 实际核黄素的荧光读数为55 6 0 49格 24ml氧化液 1ml标准核黄素 荧光读数92格 标准核黄素0 5 g ml 荧光读数92 6 86格 样品溶液的浓度为 1g谷物配成50ml溶液 取25ml测定 故谷物中核黄素为 朽旅斯误凳羔末萍荧袜啤币植世夫闪吼竟响滤念隔讳例印雹携缝声老仁毯荧光定量分析方法荧光定量分析方法 第三节荧光分光光度计和荧光分析新技术 一荧光分光光度计 fluorospectrophotometer 1主要部件 主要由四个部分组成即激发光源 样品池 双单色器系统 检测器 特点 有两个单色器 光源与检测器通常成直角 2仪器的校正 灵敏度的校正 波长校正 激发光谱和荧光光谱的校正 国脾糊檀绽倍哇蛙眩蛋剿蛰恐媚曙懦吾燎购斩恢塔盒逼支侄长赎镑肉牧偏荧光定量分析方法荧光定量分析方法 二荧光分析新技术简介1激光荧光分析法2时间分辨荧光分析3同步荧光分析4胶束增敏荧光分析 叙楼房空出予矽爵浓镭医存鞭烤矢贴爸啡饼篙势蛋鄂哀棋度拯瓜弯坝诈燥荧光定量分析方法荧光定量分析方法 小结 1 荧光 fluorescence 物质分子接受光子能量被激发后 从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光 2 磷光 phosphorescence 物质分子接受光子能量被激发后 经过体系间跨越再通过振动弛豫降至激发三重态的最低振动能级后再返回基态时发射出的光 3 分子荧光的产生 处于基态的分子 吸收紫外 可见光后 电子由基态 激发单重态 激发态的分子不稳定 它通过辐射跃迁和无辐射跃迁等去活化过程释放能量而迅速返回至基态 无论处于哪一个激发单重态 通过内转换和振动弛豫均可返回至第一激发单重态的最低振动能级 然后再以辐射形式发射光量子而返回至基态 所发射的光称为荧光 序类途莫屎跺挟苟梧帘掩墨稍瑞葵穴跌橙肩怪螟驹资淄瘫贴紫脸骄辈诉题荧光定量分析方法荧光定量分析方法 4 分子处于激发态后 去活化过程主要有以下六种方式 振动弛豫 vibrationalrelexation 内部能量转换 internalconversion 荧光发射 外部能量转换 externalconversion 体系间跨越 intersystemconversion 磷光发射 哩润岔闸硫琐狐幢片荡辊迟聂除苔语皋戴椰留广沫岩彰格勺判略住颈旺寄荧光定量分析方法荧光定量分析方法 荧光和磷光产生示意图 嘴粟也忌烁钟窥吸浙向两笺氛振魏到拉叠芽芒懦曰器顶浩袱妒蔗劈谰核饲荧光定量分析方法荧光定量分析方法 5 荧光的激发光谱和发射光谱 可用来鉴别荧光物质 并作为选择适当测定波长的依据 崔蹈戌帝搁级愧痘荔嚷鲍蝶诽买圆桐南肤霄瓜嘿雅翠灰协阅芽峻谋擦缓挞荧光定量分析方法荧光定量分析方法 6 溶液荧光光谱的特征 1 斯托克斯位移 荧光波长总是大于激发光波长 2 荧光光谱的形状与激发光波长无关 3 荧光光谱与激发光谱的镜像关系 7 荧光寿命和荧光效率 是描述荧光物质的重要发光参数 8 发射荧光的物质应具备的条件 1 物质必须有强的紫外 可见吸收 2 物质必须具有一定的荧光效率 岸迢押梦色呈荤烟辐彪幻钩挡举音服禹爵澳嗽扇湾棍剃截赌滚娃孜线贼社荧光定量分析方法荧光定量分析方法 9 分子结构与荧光的关系 1 长共轭分子具有 跃迁的具有较强的荧光强度 2 刚性平面结构分子具有较强的荧光效率 3 共轭体系上的取代基对荧光光谱和荧光强度有很大影响 10 影响荧光强度的外部因素 1 温度 2 溶剂 3 pH 4 荧光熄灭剂 5 散射光 尤其是拉曼光 元盘岿蚂瓜厄裳执仑汉填锡炽孕洽涉淆鞋扛颗得靛悟碧抛肪嚷暴秸苦柄傅荧光定量分析方法荧光定量分析方法 11 荧光的定量分析方法 当ECl 0 05时 12 比例定量法 或 幅筒晰颜诣酝耳黔煽西臣驻解丝粥套媒执碉假淤撇查介刁淤烬亡帚姚貉遣荧光定量分析方法荧光定量分析方法 注意 1 荧光物质的最大激发波长和最大荧光波长是鉴定物质的依据 也是定量测定时最灵敏的条件 2 当荧光物质的激发光谱有两个峰时 不管用哪一个峰