《核酸的分离纯化》PPT课件.ppt

核酸的分离纯化 主要内容 前言1核酸分离 纯化原则1 1保持核酸分子一级结构的完整性1 2 防止核酸的生物降解2分离提取核酸的主要步骤2 1细胞的破碎2 2核蛋白的解聚 变性蛋白的去除2 3核酸的沉淀2 4核酸的浓度测定2 5核酸的保存 核酸 nucleicacid 是遗传信息的携带者 是基因表达的物质基础 无论是进行核酸结构还是功能研究 首先需要对核酸进行分离和纯化 核酸样品质量将直接关系到实验的成败 前言 Home 1核酸分离 纯化原则 1 1保持核酸分子一级结构的完整性1 1 1意义 遗传信息全部储存在一级结构之中 核酸的 级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式 1 1 2分离核酸原则 1 温度不要过高 2 控制pH值范围 pH值5 9 3 保持一定离子强度 4 减少物理因素对核酸的机械剪切力 Home 1 2防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键 破坏核酸一级结构 所用器械和一些试剂需高温灭菌 提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂 1 2 1DNA酶抑制剂 1 金属离子螯合剂 DNA酶需要金属二价离子Mg2 Ca2 的激活 因此使用金属二价离子螯合剂 可抑制DNA酶活性 如EDTA Na2 乙二胺四乙酸二钠 8 羟基喹啉 2 阴离于型表面活性剂 如SDS 该试剂除对核酸酶有抑制作用外 还能使蛋白质变性 并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物 该复合物在高盐溶液中沉淀 1 2 2RNA酶 RNAase 抑制剂 RNAase分布广泛 极易污染样品 而且耐高温 耐酸 耐碱 不宜失活 1 皂土 bentonite 作用机制 皂土带负电荷 能吸附RNase 使其失活 2 DEPC 二乙基焦碳酸盐 C2H5OCOOCOOC2H5 粘性液体 很强的核酸酶抑制剂 作用机制 与蛋白质中His结合使蛋白变性 使用注意 1 DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环 但浓度比使蛋白质变性的浓度大100 1000倍 2 容易降解 保存在4 或液氮中 3 提RNA时 0 1 DEPC浸泡器皿37 2h 4 剧毒 3 肝素 4 复合硅酸盐 Macaloid 5 RNase阻抑蛋白 RNasin 6 氧钒核糖核苷复合物 Vanadyl RibonucleosideComplex VRC Home 1 高速组织捣碎机捣碎 2 玻璃匀浆器匀浆 3 超声波处理法 4 液氮研磨法 5 化学处理法 SDS LDS 吐温80等 6 生化法 溶菌酶 纤维素酶等 Home 2 1细胞的破碎 2 2核蛋白的解聚 变性蛋白的去除核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力 核酸与碱性蛋白的结合 氢键和非极性的范德华力 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开 同时避免核酸降解 2 2 1加入浓盐溶液 如NaCl 核酸 蛋白质加入NaCl后 破坏静电吸力 使氢键破坏 核蛋白解聚 2 2 2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外 还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能 2 2 3酚 氯仿抽提酚 氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果 并对核酸酶有抑制作用 氯仿比重大 能加速有机相与水相分层 减少残留在水相中的酚 同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用 在酚 氯仿抽提核酸提取液时 需要振摇 为防止起泡和促使水相与有机相的分离 再加上一定量的异戊醇 酚 氯 异戊醉 25 24 1 1 使用注意酚通常是透明无色的结晶 如果酚结晶呈现粉红色或黄色 表明其中含有酚的氧化产物 例如醌 二酸等 变色的酚不能用于核酸抽提实验 因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键 2 安全操作酚腐蚀性很强 并可引起严重的灼伤 操作时应戴手套 使用酚时应注意 Home 2 3核酸的沉淀 沉淀是浓缩核酸最常用的方法 优点 改变核酸的溶解缓冲液 重新调整核酸的浓度 去除溶液中某些盐离子与杂质 2 3 1核酸沉淀的盐类及浓度 当核酸溶液的pH值大于4时 核酸分子呈多聚阴离子状态 它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解 也不会被有机溶课剂变性 2 3 2有机沉淀剂 1 乙醇优点 对盐类沉淀少 沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去 不影响以后实验 缺点 需要量大 一般要求低温操作 2 异丙醇 优点 需体积小 速度快 适于浓度低 体积大的DNA样品沉淀 一般不需低温长时间放置 缺点 易使盐类 蔗糖与DNA共沉淀 异丙醇难以挥发除去 所以 最后用70 乙醇漂洗数次 3 聚乙二醇 PEG 优点 可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段 应用6000相对分子质量的PEG进行DNA沉淀时 使用浓度与DNA片段的大小成反比 注意 PEG沉淀一般需加0 5mol L的NaCl或10mmol L的MgCl2 要除去DNA沉淀中PEG 4 精胺 精胺不是有机溶剂 但可快速有效沉淀DNA 原理是 精胺与DNA结合后 使DNA在溶液中结构凝缩而发生沉淀 并可使单核苷酸和蛋白质杂质与DNA分开 达到纯化DNA的目的 2 3 3核酸沉淀的温度和时间 一般强调 核酸沉淀在低温长时间下进行 低温长时间沉淀 易导致盐与DNA共沉淀 影响以后的实验 一般使用0 冰水 10 15min DNA样品足可达到实验要求 Home 2 4核酸的浓度测定 2 4 1紫外分光光度法测DNA和RNA的含量前提 核酸样品要较纯 无显著蛋白质 酚 琼脂糖及其他核酸污染 测定浓度应大于0 25 g ml 结论 在波长260nm紫外光下 1OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50 g ml 单链DNA为37 g ml RNA为40ug ml 紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤 a 吸取一定量的DNA样品或RNA样品 加水至特定体积后 转入分光光度计的石英比色杯中 b 分光光度计先用一定量的水校正零点 c 测定待测样品在230nm 260nm和280nm的OD值 d 计算浓度 双链DNA样品浓度 g l OD260 核酸稀释倍数 50 1000 RNA样品浓度 g l OD260 核酸稀释倍数 40 1000 e 分析纯度 A 测DNA 纯的DNA样品OD260 OD280应为1 8 OD260m OD230应大于2 0 1 OD260 OD280大于1 9时 表明有RNA污染 2 小于1 6时 表明样品中存在蛋白质或酚污染 3 OD260 OD230小于2 0时 表明溶液中有残存的盐和小分子杂质 如核苷酸 氨基酸 酚等 注 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1 8的情况 测定结果分析 B 测RNA纯的RNA样品其OD260 OD280应介于1 7 2 0之间 OD260 OD230比值应大于2 0 1 若RNA样品OD260 OD280比值太小 说明有蛋白质或酚的污染 2 比值大于2 0时 可能被异硫氰酸胍等污染 3 OD260 OD230比值小于2 0时表明有小分子及盐存在 2 4 2溴乙锭荧光法测定核酸的含量 原理 DNA RNA在荧光染料溴乙锭 EB 嵌入碱基平面之间后 DNA RNA样品在紫外光激发下 可发出红色荧光 荧光强度与核酸含量成正比 使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照 可比较出被测DNA溶液浓度 注意 此法的比较主要基于目测 是估计水平 Home 2 5核酸的保存 1 对