PCR扩增和电泳检测

实验13DNA片段的PCR扩增 1 用PCR技术对DNA进行扩增2 用琼脂糖凝胶电泳技术对扩增后的DNA进行检测 实验步骤 DNA在体内复制的条件是什么 模板 酶 原料 能量 解旋酶 DNA聚合酶等 DNA分子的每条链 dATP dGTP dCTP dTTP 引物 温和的反应条件 DNA分子的结构 合成DNA分子的原料 脱氧核苷三磷酸 合成DNA分子的原料 脱氧核苷三磷酸 dATPdGTPdCTPdTTP 聚合反应机理 DNA聚合酶 不同细胞的细胞周期 PCR技术可在几小时内 将特定核酸序列扩增百万倍 PCR的概念 PCR PolymeraseChainReaction 聚合酶链反应 是指在体外 通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术 PCR的反应体系DNA模板原料 dNTP dATP dGTP dCTP TTP 酶 Taq聚合酶 嗜热细菌中分离得到 引物 单链DNA片段 Mg2 维持酶活性所必需 PCR缓冲液 维持pH 保护Taq酶 PCR技术原理 PCR三步曲 PCR仪 用于PCR的预混液 500 L体系 ddH2O310 L10 butter50 LMgCl240 LdNTP混合液20 L引物125 L引物225 L模板DNA25 LTaqDNA聚合酶5 L 标记一个微量离心管 用取样器取20 L的预混液加入到该管中 反应试剂用量PCRSuperMix10 L引物 浓度10 M 1 L引物 浓度10 M 1 L模板DNA5 LddH2O3 L总体积20 L 微量可调移液器 一档吸 二档排 PCR反应参数 变性94 30s 退火52 30s 延伸72 60s 预变性94 300s 保温72 600s 循环次数35 1 基本概念以琼脂糖凝胶作为介质 DNA在外加电场的作用下泳动的技术 2 实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子 可以形成具有刚性的滤孔 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳基本原理 琼脂糖凝胶电泳的过程 将凝胶倒入制胶器的槽中 60oC 将琼脂糖加入电泳缓冲液 在微波炉中加热溶解至透明 制胶 将梳子从制胶槽中拔出 取出凝胶板放入电泳槽中 向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶 琼脂糖凝胶电泳中缓冲液的作用1 增加电导率 2 维持电泳过程中的合适的pH 吸取PCR反应产物10 L 注意吸头要插入到管底 才能取到PCR产物 将PCR产物与加样缓冲液充分混合 吸排几次 混样 常用的上样缓冲液配方及各成分的作用 蔗糖 使样品呈色 便于上样 形成可见指示带 预测电泳进程 溴酚蓝 增加样品密度 保证DNA均匀沉入加样孔内 核酸荧光染料 可嵌合入DNA分子 在特定激发光源的激发下可发出荧光 荧光强度与DNA含量成正比 需要与加样缓冲液混合 加样 进行电泳10 20分钟 电泳 实验用的核酸荧光染料与DNA嵌合后 在DNA图谱观察仪的可见光下发射黄绿色荧光 电泳结果的观察在DNA电泳图谱观察仪中观察核酸条带并拍照 PCR的应用