实验四-细菌质粒的接合转移PPT课件

实验四细菌质粒的接合转移 李晓华程国军 一 目的要求 了解在自然条件下微生物遗传信息传递的方式 掌握细菌质粒转移的原理和流程 二 基本原理 在质粒转移过程中 供体菌与受体菌细胞通过结合作用紧密接触 质粒从供体细胞向受体转移 同时进行质粒复制 这就是结合转移的过程 按能否自主转移 将天然存在的质粒分为两大类 1 转移型质粒 多为低拷贝的大质粒 含有完整的转移操纵子基因 tra 和转移起始位点 能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移 例如 大肠杆菌 F因子 R1 R100 R6K RP4 天蓝色链霉菌 致育性因子pSCP1 pSCP2 2 非转移型质粒 多为高拷贝的小质粒 如大肠杆菌的ColE1 RSF1010等 由于缺少转移基因 tra 不能自主转移 但由于含有与F质粒类似的bom 或nic 位点或诱动基因mob mobilization 因而能被带有tra基因的转移性质粒诱动而发生转移 转移子的筛选 筛选培养基为 基本培养基 抗生素 供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型 不能在基本培养基上生长 未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平板上生长 三 实验菌株 供体菌 E coliDH5 pTR102 TcR 含有mob基因 受体菌 紫云英根瘤菌 TcS 辅助菌 E coliMM294 pPK2073 SpeR 含有tra基因 四 实验内容 准备将受体 供体 辅助菌分别培养到对数期 供体菌 E coliDH5 pTR102 TcR LB Tc20 g ml 37 震荡培养1夜 受体菌 Sinorhizobiumfredii TcS TY 28 震荡培养2天 辅助菌 E coliMM294 pPK2073 SpeR LB Spe50 g ml37 震荡培养1夜 用可调定量移液器吸取供体 辅助菌各0 4ml 吸受体菌0 6ml 都加入同一eppdorf管内 每个同学做1管 放入离心机内 10000转 min离心1分钟 倒上清 向沉淀加1ml的TY液体 用tip上下抽吸 洗涤菌体 再10000转 min离心1分钟 倒上清 留100 l左右用于悬浮菌体 倒TY平板 然后用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上 每2个同学1片 2 3片 平板 用200 l的tip抽吸eppdorf管内沉淀的菌体 打散成浓菌液 将之加到滤纸片中央 切勿倾斜平板 以免菌液流出滤纸片以外 吹干 28 培养2天 操作步骤 第一天 倒SM平板 将基本培养基 SM 溶化 加千分之一的维生素混合液 然后加相应量的四环素 15U ml 每2人1皿 另准备1瓶基本培养基 不加抗生素 用于对照 将倒好的平板用报纸包好后放入4 冰箱 备用 注 四环素在强光下易分解 向灭菌青霉素瓶中加3ml无菌水 将已培养的TY平板上的滤纸片用无菌镊子放入水中 在震荡混匀器上洗菌体 充分打散 向1ml的ep管加0 9mL无菌水 取0 1ml菌液 混匀 吸取200 L涂皿 少数同学另取稀释液 涂1板不加Tc的SM做对照 平板放28 培养4 6天后看结果 操作步骤 第三天 五 实验报告内容 转移频率 SM Tc平板的单菌落数 纯SM平板的单菌落数 SM Tc平板的单菌落数为 纯SM平板的单菌落数