实验五. 细胞染色体制备PPT课件

组织培养细胞染色体的制备 实验五 实验目的实验原理实验试剂与仪器实验步骤注意事项 了解组织细胞的培养方法 掌握染色体标本的制备方法 一 实验目的 二 实验原理 二 实验原理 处于指数生长期的细胞 经过短期培养后 用秋水仙素处理 可把细胞分裂阻截在中期 再经过低渗 固定 滴片和染色 就可获得大量中期分裂相的细胞 制片后可以清楚地对染色体进行观察 材料 具有很强生长分裂能力的细胞系 Hela细胞 白血病K562细胞 C2C12 BHK细胞等 仪器 恒温培养箱 离心机 显微镜培养瓶 移液管 载玻片试剂 培养液 RPMI1640 M199 DMEM等 胎牛血清 双抗 NaHCO3 生理盐水 肝素 1 0g L秋水仙素溶液 0 1 低渗液 0 075M LKCl 固定液 甲醇 冰醋酸 3 1 Giemsa染液 三 实验试剂及仪器 1 秋水仙素 阻止微管组装 破坏纺锤体阻断细胞有丝分裂 使染色体收缩成一定的形状 目的 获得大量的中期分裂相细胞 2 Carnoy固定液新配置的甲醇 冰醋酸混合液 3 1 能迅速穿透细胞 将其固定并维持染色体结构的完整性 还能够增强染色体的嗜碱性 达到优良染色效果 3 低渗液 0 075M LKCl 低渗的目的是凭借反渗透作用使细胞膨胀 但不破裂 染色体铺展 同时可使粘附于染色体的核仁物质散开 以便能在一个平面上观察所有染色体形态4 染料 Giemsa 不是一种单一染料 而是天青 伊红 甘油和甲醇的混合物 配制后原液储存 染色后 染色质呈红色 细胞核是蓝色 四 实验步骤 培养液4ml胎牛血清1ml 培养24小时 每ml培养液加1ug继续培养3 5小时 培养 秋水仙素 培养瓶 取样 取1ml培养液于10ml离心管 1 1000rpm离心5分钟弃上清 离心 2 加KCl8ml混匀37 处理20分钟 低渗 3 预固定 固定 加3 4滴固定液 轻轻吹打后 离心去上清 二次固定 4 5 6 加3ml固定液 2min后轻轻吹打后 固定10min 离心去上清 加3ml固定液 轻轻吹打后 固定10min后 离心去上清 三次固定 同6 制片 预冷冰片距离20cm以上玻片倾斜30 迅速吹气 过火焰3 5次 7 8 9 空气干燥 Giemsa染色10min 细水流冲洗 染色 10 11 12 吹干 镜检 13 14 1 秋水仙素处理时间要把握好 时间过长 分裂细胞多 染色体短小 反之 则少而细长2 低渗之后 要细心 温柔混匀细胞 防止细胞膜破裂 染色体散失 3 离心前配平 离心速度过高 细胞团不易打散 反之 细胞易丢失 4 载玻片要洁净 预冷 滴片时确定将材料滴在玻片上 五 注意事项 实验步骤 1 秋水仙素预处理 收集生长旺盛的细胞1ml 轻轻吹打散 加入秋水仙素1ul 继续培养6 8小时 已完成 2 预处理后的细胞 以1000rpm离心5min 去上清 3 低渗处理 加入1ml低渗液 轻轻吹打 使细胞重悬 然后补加7ml低渗液 室温下静置20min 4 预固定 加入3 4滴固定液后 轻轻混匀 避免粘连 1000rpm离心5min 去上清 5 固定 沿管壁慢慢加入3ml固定液 2min后用吸管轻轻吹打 使细胞分散 固定10min后 1000rpm离心5min 去上清 6 二次固定 加3ml固定液 吹打均匀 固定10min后 1000rpm离心5min 去上清 7 三次固定 重复第6步 8 制悬液 去上清后剩0 5ml固定液 用吸管轻轻吹打使其成为细胞悬液 9 滴片 将冰冷的载玻片倾斜30 吸取细胞悬液距离载玻片至少1m滴于载玻片上 吹散 空气干燥 10 染色 在干燥的载玻片上滴Giemsa 染色10min 细水冲洗后 空气干燥 11 镜检 在低倍镜下寻找染色体分散良好 染色适中的分裂相 油镜下观察染色体形态并计数 小鼠中期细胞染色体 2N 40 小鼠染色体核型分析 人类慢性骨髓性白血病 chronicmyelogenousleukemia Chr9和Chr22相互易位使得Chr9上的c abloncogene和Chr22上的bcrgene相连 形成融合基因 其产物是一个融合蛋白这个融合蛋白使细胞不受细胞周期的控制 导致白血病 只要一个细胞带有这种易位Chr 就会致病 猫叫综合征 Catcrysyndrome 临床表现 喉部发育不良 哭声似猫叫身体与智能发育