基因克隆简介ppt课件

基因克隆简介 一 DNA分子克隆的基本原理 基因克隆 genecloning 或分子克隆 又称为重组 技术 是应用酶学方法 在体外将不同来源的DNA分子通过酶切 连接等操作重新组装成杂合分子 并使之在适当的宿主细胞中进行扩增 形成大量的子代DNA分子的过程 克隆 clone 一指含有单一的DNA重组体的无性繁殖系 或指将DNA重组体引入宿主细胞建立无性繁殖系的过程 cloning 一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 获得待克隆的DNA片段 基因 目的基因与载体在体外连接 重组DNA分子导入宿主细胞 筛选 鉴定阳性重组子 重组子的扩增与 或表达 1 从生物有机体基因组中 分离出带有目的基因的DNA片段 2 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上 形成重组DNA分子 3 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞 亦称寄主细胞 并与之一起增殖 4 从大量的细胞繁殖群体中 筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞 并筛选出已经得到扩增的目的基因 5 将目的基因克隆到表达载体上 导入寄主细胞 使之在新的遗传背景下实现功能表达 产生出人类所需要的物质 二 用于基因克隆的工具酶 1 1 限制酶概念提出的背景20世纪30年代 微生物学家发现 微生物的噬菌体不能交叉感染 如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株 不能感染其他株 反之亦然 这种现象称为 限制现象 1962年 W Arber提出一个假设来解释上述现象 他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶 一种是核酸内切酶 能识别并切断外来DNA分子的某些部位 使外来DNA失去活性 限制外来噬菌体的繁殖 另一种是修饰酶 可对自生的DNA进行修饰 1 DNA限制性内切酶 限制性内切酶 能识别并切断外来DNA分子的某些部位 使外来DNA失去活性 限制外来噬菌体的繁殖 把这类酶称为限制性核酸内切酶 1 2 限制性核酸内切酶的命名原则限制酶的命名是采用Smith和Athens提议的方案 即名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母 大写 第2 3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母 小写 如果它的来源菌还有株系 则有第4个字母 最后用大写罗马数字 代表同一菌株中不同限制酶的编号 前三个字母用斜体表示 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母 如Hind 代表从流感噬血杆菌 Haemophilusinfluenzac d株中分离到的第3个限制酶 1 3 限制性核酸内切酶的分类 根据其识别和切割序列的特性 催化条件及修饰活性等 一般将限制酶分为I 三大类 I类 不适用于基因工程 只在肠道菌中发现 类 基因工程的工具酶 类 切割位点不在识别位点 一般离识别位点25bp 27bp 对分子克隆操作亦无实用意义 首先由H O Smith和K W Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来 1 识别位点序列 未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列 多数是回文序列 与DNA的来源无关 1 4II类限制性内切酶 分离的第一个酶是Hind 2 切割位点 切开双链DNA 形成粘性末端 stickyend 或平齐末端 bluntend 如 从识别位点处 产生平齐末端 3 粘性末端 stickyends cohensiveends 含有几个核苷酸单链的末端 G AATTC CTTAAG GAATTC CTTAA G 5 3 3 5 5 3 3 5 连接便利 4 粘性末端的意义 i 不同的DNA双链 只要粘性末端碱基互补就可以连接 ii 同一个DNA分子内连接 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子 这比连接两个平齐末端容易的多 2 DNA连接酶 从细菌DNA环化现象推测 必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶 3 1DNA连接酶 ligase 的发现 DNA复制一定有断口 1 大肠杆菌连接酶 1 两种DNA连接酶 只能连接粘性末端 3 2DNAligase的特点 2 T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端 还能连接齐平末端 1 必须是两条双链DNA 2 DNA3 端有游离的 OH 5 端有一个磷酸基团 P 3 需要能量 动物或噬菌体中 ATP大肠杆菌中 NAD 2 连接条件 基因载体是一类能自我复制的DNA分子 其中的一段DNA被切除而不影响其复制 可用以置换或插入外源 目的 DNA而将目的DNA带入宿主细胞 三 分子克隆的载体 载体具以下特征 1 具有自主复制能力 2 有可选择的标记基因 如 抗药基因 3 有多种限制酶切点 每种限制酶最好只有单一切点 4 分子量小 便于携带较大的DNA片段 能进入宿主细胞并在其中增殖 被切割后的载体 插入外源DNA后 不影响其复制能力5 使用安全 克隆载体应只存在有限范围的宿主 在体内不进行重组 不发生转移 不产生有害性状 并且不能离开宿主自由扩散 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 常用的载体有 质粒 噬菌体 粘粒 病毒 BAC YAC等 1 质粒 plasmid 载体 Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子 Plasmidchromosome 1 质粒是细菌染色体外能自主复制的环形双链DNA分子 2 编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒 3 根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少 把质粒分为严紧型复制质粒 拷贝数少 为1 5个 与松弛型复制质粒 拷贝数多 可达10 200个拷贝 4 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒 不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象 1 质粒的一般生物学特性 1 分子量大 拷贝数低 2 天然质粒的局限性 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101 分子长9 1kb 但只有一个EcoRI切点充当克隆位点 Tetr作为筛选标志 2 筛选标志不理想 ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1 colicinE1 唯一的克隆位点EcoRI正好位于这个基因的内部 第一阶段 1977年前 天然质粒和重组质粒的利用 如pSC101 colE1 pCR pBR313和pBR322 3 发展概况 pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的 第一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基因 ampr 第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 tetr 第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA复制起点 ori pBR322质粒 pBR322质粒载体优点 第一 具有较小的分子量 pBR322质粒DNA分子为4363bp 第二 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号 第三 具较高的拷贝数 而且经过氯霉素扩增之后 每个细胞中可累积1000 3000个拷贝 这就为重组DNA的制备提供了极大的方便 抗药性标志的选择 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 第二阶段 增大载体容量 降低载体长度 建立多克隆位点区和新的筛选标记基因 如pUC系列载体 2 7kb Z编码 半乳糖苷酶 将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 lacZ的a肽互补蓝白斑选择原理 乳糖操纵子 异丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactoside IPTG 结构上类似于别乳糖 是乳糖操纵子非常有效的诱导物 可诱导lac操纵子表达 但不能被 半乳糖苷酶水解 异丙基硫代半乳糖苷 IPTG 异丙基硫代 D 半乳糖苷 Isopropyl beta D thiogalactoside Xgal 5 Bromo 4 chloro 3 indolyl b D galactoside 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖糖苷 b 半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5 溴 4 氯靛蓝 Xgal 半乳糖 5 溴 4 氯靛蓝 b 半乳糖苷酶 lacZ的a肽互补 1 a 肽 lacZ b 半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 11 41氨基酸 该段基因序列连接到pUC载体上 受体菌基因组的b 半乳糖苷酶基因的缺失a肽 氨基端有缺失 不能形成活性酶 不能分解Xgal pUC质粒载体上的lacZ 编码a肽与这个缺失突变的b 半乳糖苷酶 互补 又能分解Xgal 产生蓝色物质 C端大部分 N端的11 41aa pUClacZ 受体菌lacZ 载体lacZ 与a互补 a互补的插入失活 pUC载体上LacZ 的5 端有一段多克隆位点 MCS 区 本身虽不干扰LacZ 的合成 但插入外源基因就会阻止LacZ 的合成 不能互补 lacZ 5 3 a肽移码突变 lacZ 5 3 a肽 不互补 互补 MCS 外源DNA 通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入 MCS无插入时 互补 蓝菌斑 MCS有插入时 不互补 白菌斑 IPTG诱导的结果 第三阶段 完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求 如M13mp系列载体 含T3 T7 sp6启动子载体 表达型载体及各种探针型载体 T7启动子 SP6启动子 MCS lacZ Ampr ori 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断 并将所有这些片断都与适当的载体连接 引入相应的宿主细胞中保存和扩增 理论上讲 这些重组载体上带有了该生物体的全部基因 称为基因文库 1 基因文库的构建 1 基因文库 genelibrary 1 目的基因片段的获得 四 DNA的克隆过程 2 基因组文库的构建 1 提取研究对象基因组DNA 制备合适大小的DNA片段 2 载体DNA的制备 3 DNA片段与载体连接与包装 4 重组噬菌体侵染受体菌 5 基因文库的鉴定和扩增 原位杂交 是将细菌菌落影印到滤膜上 或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落 对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来 并使之固定在滤膜上并在原位发生溶菌 DNA变性和杂交作用 原位杂交主要用来从用质粒或Cosmid构建的基因文库中寻找阳性克隆 当得到阳性克隆后 再通过Southern杂交进一步验证 通过这种方法在一张直径为9cm的滤膜上 可检测成几百到一千甚至上万个菌落 达到高通量筛选的目的 3 基因文库的筛选 原位杂交 1 cDNA 以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA 2 cDNAlibrary 2 cDNA文库的构建 mRNA cDNA 3 3 5 5 反转录酶 引物 利用某种生物的总mRNA合成cDNA 再将这些cDNA与载体连接 转入细菌细胞中进行保存和扩增 称cDNA文库 1 不含内含子序列 2 可以在细菌中直接表达 3 包含了所有编码蛋白质的基因 4 比DNA文库小的多 容易构建 4 构建cDNA文库的一般步骤 1 总RNA totalRNA 提取 3 cDNA文库的特点 提取总RNA有商业化的试剂盒 kit 2 mRNA的分离纯化 3 cDNA的合成 用OligodT 或随机引物 作引物 逆转录酶能以RNA为模板合成cDNA 4 cDNA与载体连接 在双链cDNA末端接上人工接头 即可与载体连接 转入受体菌 适用于分离在特定组织中表达的基因 在细胞周期特定阶段表达的基因 受生长因子调节的基因 以及在特定发育阶段表达的或是参与发育调节的基因 同时也可有效地用来分离经特殊处理而被诱导表达地基因 3 mRNA差别杂交或扣除杂交法分离目的基因 4 PCR扩增获得目的基因 PCR Polymerasechainreaction 聚合酶链式反应是DNA的体外酶促扩增 是利用两个短的单链引物 在体外快速扩增特异DNA片段的技术 应用热稳定的聚合酶 通过双链DNA模板的热变性 引物退火和引物延伸的重复循环 使目的DNA片段在一定时间以指数方式增加百万倍 1 PCR的概念 2 PCR原理 类似于DNA的天然复制过程 PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA解离 使之成为单链 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补链每完成一个循环需2 4分钟 重复循环 变性 退火 延伸三过程 就可2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 模板DNA变性 引物DNA复性 引物DNA延伸 4 PCR技术的应用 1 扩增某一段DNA 从基因组中扩增 从载体上扩增 组织样本原位扩增 cDNA扩增 分析模板序列 2 基因的体外诱变 2 目的DNA片段与载体分子的体外连接 3 重组DNA导入受体细胞 1 转化 transformation 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程 3 转染 transfection 大肠杆菌经噬菌体核酸所感染 随后能产生出正常噬菌体后代 叫转染 1 外源DNA导入细菌的几种方法 2 转导 transduction 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程 2 转化方法 1 热休克法 heatshock 转化效率高 高于109 gDNA 2 电转化法 简单 但转化效率不高 106 108 gDNA 10ng载体DNA 100 L感受态菌 Onice混合 静置10分钟 42 C1分钟 加入1mLLB培养基 37 摇1小时 10 100 L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入