单克隆抗体制备78581ppt课件

单克隆抗体制备 Monoclonalantibody单个B淋巴细胞克隆所产生的针对同一个抗原决定簇的抗体 分三个阶段 1 免疫Balb c小鼠 2 建立筛选方法和程序 3 杂交瘤的生成 一 动物免疫 1Balb c小鼠6 8周龄 25g左右 雌性较佳2免疫方法 1 首次腹腔免疫0 5ml抗原与福氏完全佐剂1 1的混和液 一般2 3只鼠 2 30天后加强免疫 用福氏不完全佐剂 3 15天后 尾静脉注射0 1mL水剂抗原 免疫3天后 去脾脏融合对于抗原性弱的抗原 可增加免疫次数 具体程序依抗原性质而定 可溶性蛋白 提取或表达的蛋白 50 100 g颗粒性蛋白 病毒 50 100 g细菌106CFU活细胞 哺乳动物细胞 105 7CFU活癌源细胞104 6CFU糖类 多糖 糖蛋白 100 200 g核酸100 200 g 1在液氮罐中取保存的SP2 0细胞 以MEM培养基复苏 37 CO2培养箱中培养2在对数生长期收获107 108CFU的SP2 0细胞3500g离心5min 弃上清4轻轻振动离心管以松动细胞 重悬于20mLMEM营养液中 二 骨髓瘤细胞的培养 注意要点 1如细胞外观不健康 或生长密度不好 应检测是否有支原体污染2一次用一个冻存管里的细胞融合 应避免长期培养3融合的细胞要处于对数生长期 三 饲养细胞的制备 1取清洁级ICR小鼠2只 断颈椎杀死小鼠 置70 酒精溶液中浸泡10min2将小鼠四肢固定 腹部朝上3在生物安全柜内 无菌打开小鼠腹部皮肤4用20mL注射器吸取15mLMEM营养液 注入小鼠腹腔 5轻轻挤压小鼠腹腔 并用注射器来回抽吸几次 将小鼠腹腔内的巨噬细胞吸出 置细胞瓶内待用6将饲养细胞转至50mL离心管内 500g离心5min 以HAT培养基重悬细胞 转至细胞培养瓶内待用 注意事项 1严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2吸取腹腔饲养细胞时 不能将肠道刺破 否则会造成污染3如腹腔里的脂肪块堵塞针头 应调整针头的位置 重新吸取细胞液 四 脾细胞的制备 1取Balb c小鼠2只 断颈椎杀死小鼠 置70 酒精溶液中浸泡10min2将小鼠四肢固定 腹部朝上3在生物安全柜内 无菌打开小鼠腹腔4小心分离出脾脏 置含有7mLMEM营养液的培养皿内 5用针头刺破脾脏 并用弯针头挤压脾脏 将脾细胞分离出来6用吸管吹打细胞团块 将细胞悬液吸置50mL离心管中 沉降5min7将细胞悬液吸置另外一支离心管中 500g离心5min 弃上清 沉淀以20mLMEM培养基重悬 注意事项 1严禁用燃烧的棉球对小鼠消毒2取脾脏时 如果脾脏被脂肪粘连 需小心 不能撕裂或撕碎脾脏 更不能将肠道撕破3如果脾脏没用肿胀 表明免疫效果不好 应选用备用小鼠的脾脏 五 细胞融合及培养 1以2 1混合脾脏细胞和SP2 0细胞 加至细胞融合管中2在室温下500g离心10min 弃上清3轻轻振动离心管以松动和混合细胞 后置37 水浴4在60S内用巴氏吸管将0 8mL预热至37 PEG1500缓慢加至细胞内 并轻轻抽吸两次 5在90S内 用移液管轻轻将30mL预热至37 的MEM培养基加至融合管中37 水浴5min室温下500g离心10min 弃上清在融合管内加入HAT培养基20mL 将沉淀悬浮 后移置250mL的玻璃瓶中 并加入HAT培养基30mL 后加入10 15mL饲养细胞悬液 9将细胞悬液加至96孔细胞培养板中 每孔2 3滴 约0 1 0 15mL10将细胞培养板置37 饱和湿度的CO2培养箱中培养11培养3天后可取出细胞板在倒置显微镜下观察细胞融合情况 12培养置第5天时用HAT培养基换液 换1 2137 8天用HT培养基换液 全部换液1410 14天后 杂交瘤细胞占孔底1 3以上 细胞上清变黄 可以检测融合细胞上清里的抗体 注意事项 1脾脏细胞与SP2 0细胞的比例在2 1 5 1最好2细胞融合是关键步骤 避免用力吸打3细胞融合后3天要注意检查是否污染 包括细菌和真菌 一发现污染 要尽快弃去4换液时不要影响孔底的杂交瘤细胞 不要吸出或冲散 六 杂交瘤细胞的筛选 大约有10 的杂交瘤细胞能分泌抗体 而分泌特异性抗体的杂交瘤细胞更少 故需要筛选 筛选抗体分泌细胞有多种方法 如HA HI IFA ELISA等 其中间接ELISA应用最广 注意事项 1因单抗是鼠源的 故酶标记抗抗体常用酶标羊抗鼠或兔抗鼠抗体 包括抗IgG IgM的抗体 如单用酶标记抗IgG抗体 则IgM类单抗就不能被筛选出来 2阳性克隆转移到24孔细胞培养板中 细胞长满后 上清再检测一次3筛选方法应在细胞融合前建立好 一部筛选特异单抗的方法最好 七 杂交瘤细胞克隆 在分泌特异性单抗的杂交瘤细胞中 可能混有不分泌单抗的细胞克隆 另外分泌单抗的克隆在初代不稳定 有一部分细胞染色体常丢失 为了防止不分泌抗体的细胞过度生长 在早期应对细胞进行克隆 常用有限稀释法 一般来说 杂交瘤经过3 4次克隆后就稳定了 1在克隆的前一天 准备数块含有0 1mL饲养细胞的96孔板2将24孔板里的待克隆细胞悬浮 取0 1mL细胞悬液加入0 9mL台盼蓝染色液 混匀3血液计数板计数4在24孔培养板上 对待克隆细胞悬液进行10倍比稀释 5当稀释至100CFU mL时 取1mL细胞悬液至装有10mLHT培养基的瓶中 再分别加至96孔板中 预先加有饲养细胞 0 1mL 孔6将细胞培养板置37 饱和湿度的CO2培养箱中培养10天左右 注意观察7大约3 4天在倒置显微镜下可见细胞克隆 5 7天换液一次 810天左右克隆长满 可以检测上清 注意事项 1上清液要在24h内测定2细胞计数时只计活细胞 淡蓝色 死细胞为深蓝色 且没有光泽3如有高质量的FCS 可不用饲养细胞4一个克隆需亚克隆3 4次 才稳定5如有孔污染 可向感染孔及临近孔滴加1mol mL的CuSO4溶液 七 实验室规模抗体制备 体外上清液培养1杂交瘤细胞先在25mL的细胞培养瓶中培养2细胞长满瓶底后转至50或100mL的细胞培养瓶中培养3当细胞液变黄后 收集上清液 再加新鲜的培养液 并重复收集上清2次4让细胞长至饱和状态 直至死亡 并收集上清 体内生产腹水1正常培养杂交瘤细胞2饲养Balb c小鼠 注射细胞一周前通过腹腔注射0 5mL降植烷3在细胞对数生长期收获细胞 并进行计数 将细胞数量以培养液调整至 2 10 107CFU4小鼠腹腔注射0 5mL细胞悬液 1 2周后发展成癌性腹水 5用注射器收集腹水 3 4天收集一次 每只鼠可收集2 3次6腹水5000g离心10min 收集澄清的上清 除去油脂7加入0 05 的叠氮钠 小量分装保存 长期置 70