光谱仪操作使用介绍ppt课件

紫外 可見光譜操作使用介紹 基本知識 電磁輻射與紫外光譜 光是一種電磁輻射 從波長極短的宇宙射線至波長很長的無線電構成一個連續光譜 部分電磁輻射範圍遠紫外100 200nm近紫外200 400nm可見光400 800nm近紅外800 2500nm遠紅外2500 3500nm紫外光譜由分子外層電子在不同能級間躍遷產生 朗伯 比爾定律 Lambert beer A 吸光度I0 入射光強度I 入射光通過樣品後的透射強度 摩爾吸光度 cm 1 m 1 C 摩爾濃度 mol l 光程 cm 當產生紫外吸收的物質為未知物時 其吸收強度可用表示 A 吸光度c為100ml溶劑中溶質的克數l 光程 cm 選取溶劑需注意下列幾點 1 當光的波長減小到一定數值時 溶劑會對它產生強烈的吸收 即溶劑不透明 這即是所謂 端吸收 樣品的吸收帶應處於溶劑的透明範圍 透明範圍的最短波長稱透明界限 2 樣品在溶劑中能達到必要的濃度 此濃度值決定於樣品摩爾吸收係數的大小 3 要考慮溶質和溶劑分子之間的作用力 一般溶劑分子的極性強則與溶質分子的作用強 因此應儘量採用低極性溶劑 4 為與文獻對比 宜採用文獻中所使用的溶劑 5 其它如溶劑的揮發性 穩定性 精製的再現性等 電子躍遷產生紫外 可見吸收光譜分子的總能量是其鍵能 電子能 振動能和轉動能的總和 當分子從輻射的電磁波吸收能量之後 分子會從低能級躍遷到較高的能級 吸收頻率決定于分子的能級差 其計算式為 E h 或 E hC 式中 E為分於躍遷前後能級差 分別為所吸收的電磁波的頻率及波長C為光速 h為普朗克常數 基本原理 分子的電子狀態能約為8 38 104 8 38 105 J mol 4 19 105相當於286nm處發生紫外吸收 分子振動能約為4 19 103 2 09 104 J mol 分子轉動能約為419 41 9 J mol 雖然每項能量不同 且有一定的變化範圍 但其變化均是量子化的 由上可見 分子從電子基態躍遷到電子激發態的 E遠大于振動能級 轉動能級的 E 因此 電子躍遷所吸收的電磁波是吸收光譜中頻率最高的 即紫外可見光 紫外吸收譜帶的形狀紫外吸收譜帶之所以是較寬 純的形狀 這可通過下圖加以說明 以雙原子分子為例位能曲線上的橫線表示振動能級 轉動能級未表示 分子吸收電磁波能量後 電子從基態s0躍遷到激發態 其同時伴隨有振動能級的躍遷 躍遷時核間距離保持不變 Franck Condon原理 它們和原能級 s0 v0 之間的能級差分別為I II III 由於此時還伴隨著轉動能級的躍遷 所以圍繞I II III 有一系列分立的轉動能級躍遷譜線 圖a 這種譜只能在稀薄氣態下測得 當氣態壓力增大 即濃度增大時 轉動能級受限制 形成連續曲線 b 在低極性溶劑中測定紫外吸收 還能保留一些紫外吸收的精細結構 c 在高極性溶劑中作圖 精細結構完全消失 圖d 多原子分子電子能級躍遷的種類有機化合物外層電子為 鍵的 電子 鍵的 電子 未成鍵的孤電子對n電子 它們所可能發生的躍遷 定性地可用下圖表示 基本術語a 生色團 chromophore 產生紫外 或可見 吸收的不飽和基團 如C C C O NO2等 b 助色團 auxochrome 其本身是飽和基團 常含雜原子 它連到生色團時 能使後者吸收波長變長或吸收強度增加 或同時兩者兼有 如 OH NH2 Cl等 c 深色位移 bathochromicshift 由於基團取代或溶劑效應 最大吸收波長變長 深色位移亦稱為紅移 redshift d 淺色位移 hypsochromicshift 由於基團取代或溶劑效應 最大吸收波長變短 淺色位移亦稱為藍移 blueshift e 增色效應 hyperchromiceffect 使吸收強度增加的效應 f 減色效應 hypochromiceffect 使吸收強度減小的效應 簡單分子A 飽和的有機化合物a 飽和的碳氫化合物唯一可發生的躍遷為 能級差很大 紫外吸收的波長很短 屬遠紫外範圍 如甲烷 乙烷的最大吸收分別為125nm 135nm b 含雜原子的飽和化合物雜原子具有孤電子對 一般為助色團 這樣的化合物有n 躍遷 但大多數情況 它們住近紫外區仍無明顯吸收 硫醚 二硫化物 硫醇 胺 溴化物 碘化物在近紫外有弱吸收 但其大多數均不明顯 各類化合物的紫外吸收 B 含非共軛烯 炔基團的化合物這些化合物都含 電子 可以發生 躍遷 其紫外吸收波長較 為長 但乙烯吸收在165nm 乙炔吸收在173nm 因此 它們雖名為生色團 但若無助色團的作用 在近紫外區仍無吸收 C 含不飽和雜原子的化合物在這類化合物中 屬遠紫外吸收 n 亦屬遠紫外吸收 不便檢測 但n 躍遷的吸收波長在紫外區 可以檢測 雖然n 的躍遷為禁阻躍遷 吸收強度低 但畢竟其吸收位置較佳 易於檢測 因此 在紫外鑒定中是不應忽視的 含有共軛體系的分子A 共軛體系的形成使吸收移向長波方向 右圖顯示了從乙烯變成共軛丁二烯時的電子能級的變化 原烯基的兩個能級各自分裂為兩個新的能級 在原有 躍遷的長波方向出現新的吸收 一般把共軛體系的吸收帶稱為K帶 源於德文konjugierte K帶對近紫外吸收是重要的 因其出現在近紫外範圍 且摩爾吸收係數也高 一般 10000 共軛烯吸收的計算值 注意 用上述規則進行計算時 有計算誤差較大的例外情況 當存在環張力或兩個烯鍵不處於同一平面而影響共扼體系的形成時 計算值都偏離實測 菠烯即是一例 因兩個環的張力 提高了電子基態的能量 共軛醛 酮紫外吸收 K帶 的計算 不飽和酸 酯 一些共軛羧酸的UV吸收 化合物實測值 104 計算值CH2 CHCO2H200 1 0 CH3CH CHCO2H205 1 4 CHCO2H220 1 4 222 217 5 CH3 CH CH 2CO2H254 2 5 256 30 18 208 CH3 CH CH 3CO2H294 3 7 286 60 18 208 CH3 CH CH 4CO2H332 4 9 316 90 18 208 苯苯環顯示三個吸收帶 它們均起源於苯環 的躍遷 如下表所示 其中II III為禁戒躍遷 芳香族化合物 烷基苯烷基無孤電子對 但它的超共軛效應使苯環B吸收帶略有深色位移 對E吸收帶效應不明顯 苯環上有 CH2OH CH2 nOH CH2NH2等取代時 助色團被一個或多個CH2與苯環隔離開了 因此它們的紫外吸收光譜與甲苯相近 苯環上有 CH2ph CH2CHO CH2CH CH2等取代基時 生色團被CH2隔開而不能和苯環形成共軛體系 因此紫外吸收不發生紅移 CH2的這種作用稱為 隔離效應 助色團在苯環上取代的衍生物助色團有孤電子對 它能與苯環電子共軛 所以助色團在苯環上的取代使B帶 E帶均移向長波方向 B帶被強化 同時精細結構常消失 生色團在苯環上取代的衍生物生色團在苯環上取代後 苯環的大 鍵和生色團的鍵相連產生更大的共扼體系 這使B帶產生強烈的深色位移且在200 250nm之間出現一個K帶 10000 有時B帶淹沒在K帶之中 若按對E2帶深色位移的大小 生色團排列的順序為 NO2 CHO COCH3 CO2H COO CN上述生色團都是苯環的間位定位取代基 多取代苯環a 對位取代當兩個取代基屬相同類型時 雙取代的最長吸收波長近似為兩者單取代時的最長波長 當兩個取代基類型不同時 即一個是間位定位取代基 另一個是鄰 對位定位取代基 兩個取代所產生的深色位移大於單個取代基產生的深色位移之和 這種現象可用共振效應來解釋 鄰位或間位取代此時兩個基團產生的深色位移近似等於它們單取代時產生的深色位移之和 雜芳環化合物五員雜芳環按照呋喃 吡咯 噻吩的順序增強芳香性 其紫外吸收也沿此順序逐漸接近於苯的吸收 在上述三種雜芳環中 硫的電子較氮 氧能更好地和二烯的 電子共軛 因此噻吩的紫外吸收在最長波長 生色團 助色團的取代 導致五員雜芳環的紫外吸收發生較大的變化 深色位移和增色效應 吡啶的共軛體系和苯環相類似 故吡啶的紫外吸收類似於苯的紫外吸收 吡啶在251nm處的吸收強 2000 也顯示精細結構 隔離效應與加和規律設A為生色團 B為生色團或助色團 當A與B相連生成A B時 若B為生色團 二者形成更大的共軛體系 若B為助色團 助色團的孤電子對與A形成p 共軛 相比於A A B出現新的吸收 一般均為強化了的吸收 設C為不含雜原子的飽和基團 在A C B結構中 C阻止了A與B之間的共軛作用 亦即C具有隔離效應 從另一方面來看 A C B的紫外吸收就是A B紫外吸收之加和 這稱為 加和規律 紫外譜圖的解析 紫外譜圖提供的結構資訊紫外譜圖提供的主要資訊是有關該化合物的共軛體系或某些碳基等的存在的資訊 可以粗略地歸納為下述幾點 化合物在220 800nm內無紫外吸收 說明該化合物是脂肪烴 脂環烴或它們的簡單衍生物 氯化物 醇 醚 羧酸等 甚至可能是非共軛的烯 220 250nm內顯示強的吸收 近10000或更大 這表明K帶的存在 即存在共扼的兩個不飽和鍵 共軛二烯或 不飽和醛 酮 250 290nm內顯示中等強度吸收 且常顯示不同程度的精細結構 說明苯環或某些雜芳環的存在 250 350nm內顯示中 低強度的吸收 說明碳基或共軛羰基的存在 300nm以上的高強度吸收 說明該化合物具有較大的共軛體系 若高強度吸收具有明顯的精細結構 說明稠環芳烴 稠環雜芳烴或其衍生物的存在 a 紫外光譜也是吸收光譜 解析譜圖時 應同時顧及吸收帶的位置 強度和峰的形狀三個方面 從吸收帶位置可估計產生該吸收的共軛體系的大小 吸收強度有助於K帶 B帶和R帶的識別 從吸收帶形狀可幫助判斷產生紫外吸收的基團 如某些芳環衍生物 在峰形上顯示一定程度的精細結構 解析紫外譜圖方法及有關注意事項 b 立體位阻的作用常使一些共軛體系的吸收帶發生明顯的藍移 這是由於共軛體系的共平面性受到破壞所致 C 介質的影響在進行紫外測定時 介質常有較重要的影響 總的說來 相對於該化合物蒸汽的紫外吸收 低極性溶劑的溶液其紫外吸收變化小 高極性溶劑的溶液其紫外吸收變化大 且精細結構消失 因此一般應儘量採用低極性溶劑 n 躍遷 當溶劑極性增強時 有明顯的藍移 其原因為化合物基態較激發態極性強 它和極性溶劑形成較強烈的氫鍵 從而增加了躍遷的能量 導致藍移 躍遷 當溶劑極性增強時 常有紅移 不如n 躍遷溶劑極性增加時的藍移明顯 其原因為激發態極性較基態大 當溶劑極性增加時 激發態因生成較強的氫鍵 能量降低較多 因而有紅移 苯環E2帶 204nm 的溶劑效應需視衍生物個取代基的性質而定 取代基為鄰 對位取代基時 溶劑效應很小 取代基為間位取代基時 隨溶劑極性的增加而產生紅移 對具有酸鹼性的一些有機物 如 酚 苯胺等 溶液的PH值對其吸收位置有很明顯的影響 最常用的標推譜圖仍為薩特勒 Sadtler 紫外譜圖 因它同時有核磁共振氫譜 核磁共振碳譜 紅外譜 且有上述譜圖的綜合索引 因此查閱薩特勒譜圖是十分方便的 其查閱方式和查薩特勒紅外譜相似 紫外光譜在決定一系列維生素 抗菌素及一些天然物結構曾起過重要作用 如維生素A1 A2 B12 B1 青黴素 鏈黴素 土黴素 螢火蟲尾部的發光物質等 例如 CS2 CH3CHOC5H10N2S2有兩種可能結構 利用UV譜進行判斷 紫外光譜應用舉例 NH3 A B 解 先選取兩個模型化合物 max 276 2 1 104 246 8 103 max 217 8000 實測未知物 A或B 的UV數據為 由此推測為化合物A max 288 1 28 104 243 8000 松香酸235 248nm 左旋海松酸260 283nm 紫外吸收光譜用來決定雙鍵的位置 既簡單又有效 例如 又如 紫羅蘭酮 紫羅蘭酮 紫羅蘭酮由於雙鍵共軛 其紫外吸收波長較 紫羅蘭酮明顯地到了長波方向 一 整機結構UV 1201紫外可見分光光度計分光光度計主機由光源 單色器 樣品室 檢測系統 電機驅動 電腦介面 電源等部分組成 UV 1201紫外可見分光光度計的使用 軟體的啟動 啟動UV 1201紫外可見分光光度計應用程式 軟體將自動進入到自檢畫面 自檢前請先將儀器預熱至少10分鐘 基本操作 設置換燈點 1 在 設置 儀器 功能表列中可以設置換燈點 建議除特殊測量 如氘燈譜線 外不要更改 2 開關氘燈和鎢燈 如果長時間不用氘燈或鎢燈 可以在自檢後點擊 設置 儀器 功能表下的氘燈或鎢燈鍵將其關閉以節省燈的壽命 但在關閉之後需間隔最少1分鐘才能重新開啟 並需要預熱最少10分鐘才能使儀器達到最佳的測量效果 光譜掃描光譜掃描測量方式可用於樣品的定性分析 它如實地顯示樣品的全波長圖譜 或列印出來 是化學分析工作者的常規分析手段 1 啟動光譜掃描功能點擊工具列上的 光譜 項 再點擊 參數 進入參數頁面 參數有兩種類型 選擇型和輸入型 選擇型 使用者將滑鼠指點到相應的選項按一下即可 如測量方式 取樣間隔 光譜頻寬 輸入型 需輸入數位量 如 波長範圍 光度範圍 以下幾個參數在使用中應注意 A 光度範圍 此參數與測量無關 如選擇不當 顯示的圖譜會失真或根本看不見 但測量結束或測量過程中可重新將其調到合適的範圍 B 取樣間隔 光譜峰谷尖銳的應選取較小的取樣間隔 但間隔越小測量所需的時間越長 同時掃描點數 波長範圍除以取樣間隔 不應超過10000點 C 掃描速度 掃描速度的選擇取決於所需要的測量精度 速度越慢測量精度越高 但測量的時間也越長 一般測量快速即可 2 測量運行a設置好參數後 將參比和樣品分別放入樣池的參比位和樣品位 蓋好樣品室蓋 按下 測量 按鈕 選擇好樣品所在樣池 便可進行測量 早測量中途若需中斷 可按一下 停止 按鈕 或直接關閉此頁面 畫面右上角第二排 關閉 欄 B如果在參數設置的 參比測量 項中選擇了 單次 則在波長範圍和取樣間隔都不改變的情況下 下一次測量將直接測量樣品 如果選擇 重複 則每次測量都會重新測量參比 3 波長掃描功能下的圖譜處理按一下 資料處理 下的圖譜處理功能表功能項 便可進行圖譜處理 A 尺規查數 選擇工具列上 尺規 鈕或功能表資料處理 尺規查數 選項可顯示尺規 在按隱藏 左右挪動滑鼠或按鍵盤方向鍵 可使尺規移動到要觀察的圖譜點 當前尺規所在點的資料將顯示在右方的導航器中 b峰穀檢測 峰穀檢測靈敏度是進行峰穀判斷的唯一標準 靈敏度的選擇應根據使用者需要進行 靈敏度值過小會導致峰穀過多 不好判斷 靈敏度值過則可能檢測不到需要的峰穀 峰穀檢測最多顯示100個檢測資料 單擊 峰谷檢測 按鈕 根據需要在彈出的對話方塊中輸入峰穀檢測靈敏度數值 按一下 確定 按鈕便可檢測出當前圖譜的峰穀 綠 為峰 紅 為穀 同時顯示檢測的峰穀數值 資料後面的P代表峰值 V代表谷值 光度測量此測量方法可用於多個波長的定點測量 最大波長點數10個 啟動光度測量功能按一下工具列上 光度 按鈕 再點 參數 進行參數設置 測量是依次進行 輸入時若按波長從大到小排列可以加快測量速度 測量運行如果選擇了 比色皿校正 功能 在測量前必須進行比色皿配對測量 設置好參數後 在參比池和樣品池中都加入參比溶液 蓋好樣品室蓋 按下 校正 按鈕 儀器自動進行校準 校正完成後即可進行正式的樣品測量 使用同一比色皿時可多次測量而不需要重新校正 如果沒有選擇 比色皿校正 功能 則直接放入參比和樣品 按一下 測量 按鈕進行測量 時間測量用此測量方法可以觀察樣品隨時間的變化情況 計算樣品的活性值 還可以用此功能考察儀器的穩定性及雜訊 啟動時間測量功能按一下工具列上 時間 按鈕 進行參數設置選擇測量方式 系光度 Abs 透過率 T 並輸入顯示光度範圍 測量時間 測量波長和取樣間隔 測量運行如果選擇了 比色皿校正 功能 在測量前必須進行比色皿配對測量 設置好參數後 在參比池和樣品池中都加入參比溶液 蓋好樣品室蓋 按下 校正 按鈕 儀器自動進行校準 校正完成後即可進行正式的樣品測量 使用同一比色皿時可多次測量而不需要重新校正 如果沒有選擇 比色皿校正 功能 則直接放入參比和樣品 按一下 測量 按鈕進行測量 定量分析定量分析有多中測量方式 單波長標準係數法 雙波長等吸收點法 雙波長係數倍率法 三波長法 關於雙波長法與三波長法的理論與應用請參看有關資料 啟動定量分析功能按一下工具列上 定量 按鈕 單波長標準係數法進入定量分析功能後 點擊 參數 按鈕 進入參數頁面 如下圖 單波長標準係數法有兩種測量方式 濃度和係數 如果已知回歸函數的係數 則採用係數法 如果用已知標準濃度溶液來建立曲線來測量 則採用濃度法 曲線擬合方式有兩種 線性擬合和2次擬合 在測量前首先確定測定波長值 選擇好擬合方式 確定是否需要將零點作為擬合的有效點 僅對濃度法有效 即已知標樣在寧德為零時的吸光度值也為零 所以直接將零點加入資料中參與最小二乘法的擬合 濃度法在定量分析參數設置對話方塊中 輸入測量波長值 選擇擬合方式 選擇是否插入零點 輸入標樣濃度個數 同時在濃度標樣中輸入對應的濃度值 設置完畢後 按下 確定 按鈕 進入測量介面 如果用戶已經知道標樣的吸光度 也可直接按兩下標樣測量介面下對應的吸光度欄 以輸入法來快速的建立曲線 這時可跳過a2 a3和a4步驟 如果選擇了 比色皿校正 功能 在測量前必須進行比色皿配對測量 設置好參數後 在參比池和樣品池中都加入參比溶液 蓋好樣品室蓋 按下 校正 按鈕 儀器自動進行校準 校正完成後即可進行正式的樣品測量 使用同一比色皿時可多次測量而不需要重新校正 如果沒有選擇 比色皿校正 功能 則直接放入參比和樣品 按一下 測量 按鈕進行測量 按下標樣按扭 此鍵將變成未知樣 此按扭用於定量分析功能下切換標樣與未知樣的測量頁面 同時進入濃