VEGF-B基因靶向siRNA对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤影响

欢迎各位专家老师莅临指导 VEGF B基因靶向siRNA对人肝癌细胞HepG2细胞裸鼠皮下种植瘤的影响 导师唐瑞峰教授研究生吴剑飞河北医科大学第四医院肝胆外科 前言 原发性肝癌与VEGF B最常见的恶性肿瘤之一 发病率升高 恶性程度高 进展迅速 易侵袭 转移 复发 肿瘤生长和转移依赖于肿瘤血管新生 血管内皮生长因子家族成员 vascularendothelialgrowthfacterfamilymembers VEGFs 是影响肿瘤血管新生的关键因子之一 VEGF B是VEGF家族新成员 在原发性肝癌等恶性肿瘤中存在高表达 目前研究表明VEGF B可协同VEGF A和其他血管生成因子 在肿瘤血管新生中发挥作用 但具体机制仍知之甚少 siRNA1998年由Fire等人首次提出 概念 一种由双链RNA double strandedRNA dsRNA 诱导的抗双链反应 进而导致序列特异性的基因沉默 一种由20多个核苷酸组成的短片段双链RNA分子 按同源互补序列的mRNA为标靶从而使特定的mRNA降解 这种在转录后水平抑制基因表达的机制被称为RNAi机制 一种研究基因功能的利器 目前广泛应用于医学遗传学 分子生物学 疾病基因治疗等各方面的研究 肿瘤基因治疗的新思路 siRNA siRNA在恶性肿瘤基因治疗中的优点 高效性 高特异性 高稳定性 实验设计思路前人得出VEGF B在肝癌细胞中存在高表达在裸鼠体内试验中 VEGF B与肝癌发生发展的关系在裸鼠体内试验中 VEGF B低表达对肝癌发生发展的影响 实验技术路线 杀稻瘟菌素稳定筛选具有其抗性的HepG2细胞 扩增稳定筛选的HepG2细胞 注射到裸鼠皮下成瘤 并建立阴性对照 提取肿瘤组织VEGF BmRNA RT PCR 统计实验数据 得出实验结论 观察各组裸鼠皮下种植瘤生长情况 体积 重量 VEGF B靶向siRNA瞬时转染人肝癌细胞HepG2细胞 材料与方法 材料 人肝癌细胞株HepG2细胞 由河北医科大学第四医院科研中心提供 雌性无胸腺裸小鼠 4 5周龄 SPF级 购于中国医学科学院动物研究所 动物合格证号 0240722 在河北医科大学第四医院动物实验中心无特定病原菌 SPF 级条件饲养 细胞培养试剂 DMEM培养基GIBCO公司胎牛血清 FCS 杭州四季青公司胰蛋白酶 trypsin 美国Sigma公司PBS液参照 细胞培养 二甲基亚砜 DMSO 天津市化学试剂厂 试剂 VEGF B靶向siRNA表达载体质粒Invitrogen公司LipofectamineTM2000Invitrogen公司杀稻瘟菌素 blasticidin Invitrogen公司OPTI MEMGIBCO公司 基因转染试剂 RNA提取和RT PCR试剂 dNTPInvitrogen公司M MLVInvitrogen公司OligoInvitrogen公司5 第一链合成缓冲液Invitrogen公司溴酚兰Invitrogen公司 actin引物Invitrogen公司VEGF B引物Invitrogen公司TRIquick试剂Solarbio公司 氯仿北京化学试剂厂异丙醇北京化学试剂厂乙醇北京化学试剂厂焦碳酸乙二酯 DEPC 美国Amresco公司琼脂糖美国promega公司DNAMaker 1100 美国promega公司琼脂糖美国promega公司溴化乙锭 EB sigma公司 仪器 CO2恒温培养箱MCO 18AIC型超净工作台SW CJ IF型倒置相差显微镜XD 101型普通光学显微镜核酸蛋白测定仪NANODROP1000PCR仪VERITI型凝胶成像系统FOTODYNE60 2107型小型瞬时离心器CT10型低温超速离心机TTICH 400型超低温冰箱MDF V50V型 电子分析天平JA5003型移液器涡旋混匀器XH B型电泳仪DYY 6C型电泳槽DYCZ 38B型倒置荧光显微镜TE2000 U型电热恒温干燥箱恒温水浴箱HXS H型裸鼠饲养笼 美国克罗多拉州生产 实验方法 杀稻瘟菌素稳定筛选VEGF B靶向siRNA转染的HepG2细胞 HepG2 siRNA 扩增细胞注射足量HepG2 siRNA细胞入裸鼠肋部皮下 成瘤5周 期间观察瘤体体积 测量重量 RT PCR两步法检测实验组和对照组裸鼠皮下瘤VEGF BmRNA的表达 统计学方法 采用SPSS13 0统计软件进行分析 计量资料均采用均数 标准差表示 采用方差分析P 0 05为差异有统计学意义 结果 Fig 1ImageoffluorescencemicroscopyinHepG2cellat48haftertransfectedwithcontrolofpcDNATM6 2 GW EmGFP miR a innomalfield 100 b influorescentfield 100 c innomalfield 100 d influorescentfield 100 emptyplasmidgroup experimentalgroup Fig 2Nudemiceonday35afterinoculatedwithHepG2cellstransfectedstablywithVEGF BsiRNAexpressionplasmid Fig 4subcutaneousimplantedtumorofnudemice a controlgroup b experimentalgroup a b Fig 3Thebarchartsareexpressedastheaveragetumorvolumeandtumorweightineverygroup comparedwithPs0group P 0 05 Fig 4ExpressionofVEGF BmRNAindifferenttransfectedgroupingswasdetectedbyRT PCR M Marker 0 Ps0group 1 Ps1group 2 Ps2proup 3 Ps3group Fig 5ThebarchartsareexpressedastheIODratioofVEGF Band actinineverygroup comparedwithPs0group P 0 05 Table1TheeffectofVEGF BsiRNAonthegrowthofHepG2cellsimplantedtumorinnudemice s comparedwithPs0group P 0 05 Table2TheVEGF BmRNAexpressionofVEGF BknockdownwithsiRNAontheinvasionofHepG2cellsimplantedtumorinnudemice s comparedwithPs0group P 0 05 讨论 VEGF B有两种存在形式 即VEGF B167和VEGF B186 二者都是以二硫键相连的同源二聚体其单体可以与VEGF A的单体形成二硫键连接的异源二聚体 协同促进肿瘤血管生成VEGF B主要通过与其受体Flt 1结合 发挥促血管内皮生长和迁移作用Kanda等研究发现肝癌组织中VEGF B的表达水平高于正常肝组织 唐瑞峰等研究发现VEGF B蛋白在肝癌组织中阳性表达率最高 而在癌旁组织 正常肝组织中阳性表达率呈逐渐下降趋势 VEGF B受体Flt 1的表达率与VEGF B成正相关VEGF B可能在肝细胞癌的发生发展过程中是一个关键的作用靶点为此 我们引入世界上较为先进siRNA技术 通过构建VEGF B基因的siRNA载体质粒 转染至肝癌细胞中 导致VEGF B的RNA干扰 RNAi 效应 siRNA技术一种新的基因阻断技术 能够高效 简单的阻断某一特定基因的表达 它不仅是研究基因功能的有力工具 而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段具体干扰机制分为 起始阶段和效应阶段在起始阶段 Dicer酶与双链RNA特异性结合 双链RNA被切割成21 23nt长度的小干扰RNA在效应阶段 siRNA与核酶复合体参与合成RNA诱导的沉默复合体 RNA inducedsilencingcomplex RISC 并被激活 激活的RISC在胞浆解旋双链siRNA RISC内部核酸内切酶负责催化其内部的单链siRNA去识别与之互补的mRNA链 并对其进行切割 最终在核酸外切酶的作用下降解切断后的mRNA 从而阻止靶基因的表达 RNAi模式图 RNAi技术在现代肿瘤基因治疗中的应用沉默与肿瘤侵袭转移相关的基因表达 如血管内皮生长因子信号通路相关的各种基因可封闭由原癌基因突变激活的癌基因 由于RNAi具有高特异性的优点 可利用RNAi技术特异性阻断癌基因的表达 而对其他正常基因没有沉默作用可抑制细胞周期相关基因的过表达可下调细胞凋亡调控机制紊乱导致相关基因的过表达可抑制与肿瘤细胞无限增殖有关的端粒酶的表达 有研究表明 通过siRNA技术阻断VEGF A165的生成 可显著抑制包括肝癌细胞 Hela细胞 卵巢癌细胞等多种癌细胞的生长WuX等构建趋化因子受体1基因靶向siRNA质粒载体介导入肝癌细胞HCCLM3中 使该癌细胞的侵袭能力降低陆彬彬等把VEGF靶向siRNA质粒载体转染肝癌细胞 SMMC 7721 可阻断大部分VEGF蛋白的表达 降低细胞增殖能力 卢小东等构建人端粒酶逆转录酶亚基 hTERT 靶向siRNA导入肝癌细胞HCCLM3细胞中 可抑制端粒酶的表达 从而抑制肝癌细胞增长并促凋亡 我们实验结果显示 1 对照组荷瘤裸鼠成瘤体积明显大于三种VEGF B干扰组的成瘤体积2 RT PCR检测肿瘤组织内VEGF BmRNA的表达量 发现对照组裸鼠明显高于三组干扰组裸鼠 提示 下调VEGF B在肝癌细胞中的表达 可明显减慢肿瘤在体内的生长和发展 结论 1 下调VEGF B表达可有效抑制人肝癌细胞HepG2细胞生长增殖能力 但不能完全阻断肝癌的发生和进展 2 VEGF B可作为肝癌基因治疗的新的有效的靶点 致谢 值此论文完成之际 首先我要衷心感谢我的导师唐瑞峰教授对我的悉心指导和培养 导师高尚的品格 严谨的治学态度 务实的工作作风 正直谦和的性格 身体力行的育人方法和诲人