体液常规形态学检查及其自动化标准化探讨

体液常规形态学检查及其自动化标准化探讨,上海第二军医大学长海医院周道银,一、体液常规细胞形态学检查概述二、浆膜腔积液常规形态学检查三、粪便常规形态学检查四、支气管肺泡灌洗液形态学检查五、体液形态学分析自动化、标准化探讨,内 容,一、体液常规细胞形态学检查概述,体液细胞形态学检查是指除血液以外的各种体液，如胸水、腹水、心包液、关节液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等，在完成一般性常规检验的基础上，将沉渣制成涂片，经瑞吉染色后，在显微镜下进行细胞形态学观察，作出检验诊断（报告细胞分类、肿瘤细胞、狼疮细胞、噬菌细胞、真菌、寄生虫和结晶等）。该检查是集基础理论、临床知识 ；实验方法、涂片染色、实践经验于一体的综合技术；可称为体液常规细胞形态学检查。其目的是提高检验质量，提升常规检验应用价值。,体液标本种类,胸液、腹液、心包液、脑脊液、痰液、胃液、十二指肠液、胆囊液、胰液、羊水、精液、前列腺液、泪液、唾液、耳道分泌物、鼻腔分泌物、乳腺分泌物、阴道分泌物、尿道分泌物、肿块/囊肿液、脓肿液、引流液、关节腔积液、阴囊积液、肺泡灌洗液、腹膜透析液、胸腔冲洗液、腹/盆腔冲洗液、尿液、粪便等三十余种。,形态学检查价值,形态学检验是检验学科最基本的技能，是临床实验室诊断最简便、最特异和最经济实用的常规检验方法。形态学检验是某些疾病诊断的“金指标”，是判断疾病疗效和预后的重要依据。检验诊断报告具有参考诊断、鉴别诊断、确定诊断价值。形态学检验是常规检验的重要内容，但由于自动化仪器的应用，检验人员，尤其是青年技术人员的形态学技能越渐弱化，现在特别需要加强形态学人才培养，使这一对某些疾病具有重要诊断价值的经典技术传承光大。,体液形态学检查的法规依据,医学实验室质量和能力专用要求 （GB/T 22576-2012/ISO15189:2012）医疗机构临床实验室管理办法 (卫生部 卫医发200673号)医疗机构临床检验项目目录（卫生部 卫医发2007180号） 胸腹水常规检查 包括外观、比重、粘蛋白定性、细胞计数、细胞分类 胸腹水细胞学检查 包括浓缩查肿瘤细胞 各种穿刺液及分泌物细胞学检查 包括嗜酸、肥大细胞、肿瘤细胞等全国临床检验操作规程（卫生部 第四版 2015.03）,体液常规检验能否筛查肿瘤细胞,全国临床检验操作规程第4版： P175 粪便检查 乙状结肠癌、直肠癌患者的血性粪便涂片染色可见到成堆的癌细胞。 P178 脑脊液检验 染色分类法:脑脊液找到癌细胞是临床确诊脑膜癌的重要手段。 P182 痰液检验 肿瘤细胞见于原发性或转移性肺癌。 P184 支气管肺泡灌洗液检验 检查癌细胞有利于肺部肿瘤的诊断。 P185 浆膜腔积液检验 瑞吉染色分类。HE或巴氏染色找癌细胞。 P188 精液检验 精液中出现癌细胞可为生殖系统恶性肿瘤的诊断提供依据。 P194 前列腺液检验 前列腺癌时可见癌细胞。,体液常规形态学检验内容,细胞形态学 细胞计数 细胞形态及分类病原生物及其它形态 真菌、细菌、寄生虫、结晶等理化检验,二、浆膜腔积液常规形态学检查,正常情况下，人体的胸腔、腹腔和心包腔、关节腔统称为浆膜腔。浆膜腔内仅含有少量的液体起润滑作用。一般采集不到。在病理情况下，浆膜腔内有大量液体潴留而形成浆膜腔积液。可采集积液进行各种检验，以鉴别积液性质和查找病因。具有鉴别诊断、参考诊断、确定诊断的作用。,用于不同病因引起的漏出液与渗出液的鉴别。如肝硬化、心衰等引起的漏出液；结核、细菌、真菌感染、创伤和肿瘤等引起的渗出液。用于病原生物体的初步判定。如细菌、真菌、寄生虫、结晶等。用于恶性积液的诊断。恶性积液约占所有积液的20-30。对于积液原因待查病人，检出恶性细胞的信息报告，临床医生通常于第一时间优于其它检查获得结果回报。,浆膜腔积液检查的临床应用,用于良性疾病的诊断。如在积液中找到狼疮细胞、卡氏肺孢子菌、噬细菌细胞、噬真菌细胞、郎格汉斯细胞、嗜酸性粒细胞增多、中性粒细胞增多、胆红素结晶、胆固醇结晶等，为临床查明积液原因提供了重要诊断依据。用于肿瘤术后的疗效和癌性积液腔内化疗的疗效评估。如在肿瘤术后病人的浆膜腔积液中找到肿瘤细胞，证明肿瘤已发生转移；如在腔内化疗的积液中未找到肿瘤细胞，证明治疗有效。,浆膜腔积液检查的临床应用,浆膜腔积液良性、恶性疾病比例,浆膜腔积液常规形态学检查内容,颜色、透明度、蛋白定性、细胞总数计数、有核细胞计数、细胞分类。 形态学及有核细胞分类检查借助显微镜完成 细胞总数计数、有核细胞计数 细胞分类、形态学观察,浆膜腔积液细胞成份,积液细胞成份： 上皮源非肿瘤细胞：间皮细胞 上皮源肿瘤细胞：癌细胞、恶性间皮瘤细胞 造血淋巴组织非肿瘤细胞：中性、淋巴、巨噬细胞等 造血淋巴组织肿瘤细胞：淋巴瘤细胞、白血病细胞 病原生物及其它：细菌、真菌、寄生虫、结晶,浆膜腔积液标本采集,浆膜腔积液标本由穿刺术采集第一管细菌学检查，必须留于无菌试管第二管化学及免疫学检查（宜用肝素抗凝）第三管常规检查（宜用EDTA-Na2 抗凝）第四管不加任何抗凝剂，以观察有无凝集现象。 标本收集后必须立即送检，以防细胞变性、出现凝块或细胞破坏溶解。,其方法是将离心后标本弃上清液,留约0.05ml沉渣，取5-8l, 置于清洁玻片的右侧端,用一推玻片压在沉渣上,形成2530度角,迅速向另一侧推进,制成涂片。每份标本推6张涂片：2张有尾薄片、2张有尾厚片、2张无尾厚片。有核细胞浓集（离心后沉渣量）和制作涂片是提高恶性细胞检出率最关键的操作技术,推片法制作涂片,备用涂片开展其他染色,如抗酸、化学和免疫化学染色等,有尾薄片x2,有尾厚片x2,无尾厚片x2,瑞吉染色:细胞形态染色鲜艳、结构清晰,便于良恶性细胞的辨认和鉴定每例标本至少观察2份涂片先用低倍镜扫描全片,寻找可疑细胞再用油浸镜鉴定细胞性质恶性细胞易分布于无尾片的尾部,涂片染色与镜检,有核细胞分类及异常细胞报告,低倍镜扫描2份涂片后，选择细胞分布均匀处，计数100-200个有核细胞,按各占百分比报告。如中性粒细胞60%,淋巴细胞25%,巨噬细胞10%,嗜酸性粒细胞5%。同时报告其它异常形态，如恶性细胞、狼疮细胞等。,腹水 嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞,胸水 淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞,心包积液 淋巴瘤细胞,胸水涂片 间皮细胞（红色箭头所示）、淋巴细胞、巨噬细胞,腹水 癌细胞,恶性肿瘤细胞的典型形态,典型恶性肿瘤细胞病例占所有查见恶性细胞病例的80%以上,胞体、胞质、胞核的形态特征，简要概括为 “三大三千”,三 大胞 体 大胞 核 大核 仁 大,三 千形态千姿百态胞质千变万化胞核千奇百怪,胸水 癌细胞,腹水涂片 癌细胞 (瑞吉染色X1000),胸水 癌细胞,心包积液 癌细胞,腹水涂片 什么细胞？,腹水涂片 箭头所指什么细胞？,胸水涂片 什么细胞？,胸水涂片 箭头所指什么细胞？,胸水涂片 什么细胞？,恶性肿瘤细胞的不典型形态, 不典型形态是指浆膜腔积液中的低分化、未分化的各类型小恶性肿瘤细胞，与组织学的低分化、未分化不是同一概念。 恶性细胞特点：体积小，约10-30m左右；形态核形多样；核质比增高；核染色质粗密不均，或细致均匀，易见核仁。细胞分布可单个散在，也可与巨噬细胞、间皮细胞混合成簇。排列可呈疏松成群、聚集成团，腺腔样、桑椹样、链状、脊椎骨样排列。此类细胞与间皮细胞、巨噬细胞大小相似，容易误认、较难以区别。此是形态学技术难点，应高度重视。 不典型恶性肿瘤细胞病例约占所有查见恶性细胞病例的10%-15%。,胸水 1癌细胞 2巨噬细胞,腹水 癌细胞 巨噬细胞 嗜酸性粒细胞,心包积液 癌细胞 疏松成群排列,胸水 癌细胞 疏松成群排列,胸水 癌细胞 疏松成群,胸水 癌细胞 脊椎骨样排列,浆膜腔积液常规形态学对恶性积液检验诊断性能,总结12000例患者（14708份标本）浆膜腔积液资料，积液常规细胞形态学检验方法对恶性积液的诊断性能： 诊断灵敏度78.00%， 诊断特异性98.88%， 阳性预期值97.18%， 阴性预期值90.08%， 总有效率91.97%。,三、粪便常规形态学检查,细胞：红细胞、白细胞、吞噬细胞、肿瘤细胞病原生物及其它：寄生虫、细菌、真菌、结晶等当常规镜检发现可疑细胞或寄生虫（尤其原虫）时，涂片应作相应的染色如瑞吉、革兰、碘液、铁苏木素染色等，仔细鉴定形态以提高阳性检出率。,受精蛔虫卵 未受精蛔虫卵,粪便 粪类圆线虫,粪类圆线虫（杆状蚴）形态： 体壁透明，头端钝圆，虫体肥胖，尾部尖锐无分叉，虫体长约180-230m，宽约15m，其咽管长度约为虫体长的1/41/5。粪类圆线虫感染人体后可寄居于人的肠道引起相应的症状。当患者抵抗力低下，粪类圆线虫迅速繁殖，通过小血管、淋巴管移行到肺部出现呼吸道症状。幼虫在肺脏移行时可引起过敏性肺炎和哮喘，表现为发热、咳嗽、咯痰等。,BALF 粪类圆线虫 （瑞吉染色）,粪便及BALF中查见粪类圆线虫患者，男，反复咳嗽，咳粘痰，胸部不适就诊。,粪便涂片只有瑞吉染色才能检出嗜酸细胞,患者男，慢性肠炎，季节性加重， 粘液便，红细胞4-6个/高倍视野，白细胞20-30个 /高倍视野，涂片瑞吉染色查见嗜酸细胞增多，最后诊断过敏性肠炎,粪便检出嗜酸性粒细胞,患者，因腹痛、脓血便住院。粪常规，粘液血便，红细胞满视野/HP，白细胞50-60/HP，见吞噬细胞和异常细胞，涂片瑞吉染色镜检：查见可疑恶性细胞。纤维肠镜见结肠有一3.34.1cm新生物，活检病理诊断结肠腺癌。,粪便癌细胞（瑞吉染色X1000） 肠镜活检 免疫组化 CA242+（200倍）,粪便检出癌细胞,四、支气管肺泡灌洗液形态学检查,概 述 2002年中华医学会呼吸病学分会制定出支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范（草案）。从标本采集、细胞计数、涂片制备及染色，有核细胞分类到T细胞亚群检测等方面均作出了详细的操作说明。 支气管肺泡灌洗液（BALF）检查 ，见第四版操作规程P184。目前纤支镜应用的医院越来越多，临床对检验科开展BALF检查的要求越加迫切。BALF的实验室检查已成为检验科的常规检验项目。 检验技术人员怎样做好BALF 检验，尤其是如何识别BALF中的纤毛柱状上皮细胞，肿瘤细胞，巨噬细胞，卡氏肺孢子菌等，保证BALF细胞形态学检验诊断的准确和及时有效，是检验技术人员亟待解决的问题。,支气管肺泡灌洗液检查（BALF）,部位：中叶、舌叶或病变相应肺段每次20-50ml盐水，共100-250ml负压50-100 mmHg，回收40-60%细胞总数：90-260106/L分 类：肺泡巨噬细胞 0.930.03 淋巴细胞 0.070.01 N和E均 0.01T细胞亚群：总T细胞（CD3+）0.7 T辅助细胞（CD4+）0.5 T抑制细胞（CD8+）0.3 CD4+ / CD8+ 为1.5-1.8其他检查：病原体、细胞学、免疫球蛋白、表面活性物质、肿瘤标志物等多种内容。,注：罗慰慈 现代呼吸病学 1997，BALF细胞总数 100-150106/L,支气管肺泡灌洗液检查（BALF）,部位：中叶、舌叶或病变相应肺段每次20-50ml盐水，共100-250ml负压50-100 mmHg，回收40-60%细胞总数：90-260106/L分 类：肺泡巨噬细胞 0.930.03 淋巴细胞 0.070.01 N和E均 0.01T细胞亚群：总T细胞（CD3+）0.7 T辅助细胞（CD4+）0.5 T抑制细胞（CD8+）0.3 CD4+ / CD8+ 为1.5-1.8其他检查：病原体、细胞学、免疫球蛋白、表面活性物质、肿瘤标志物等多种内容。,注：罗慰慈 现代呼吸病学 1997，BALF细胞总数 100-150106/L,健康成年人BALF细胞总数及细胞分类统计,American Thoracic Society DocumentsAn Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline: The Clinical Utility of Bronchoalveolar Lavage Cellular Analysis in Interstitial Lung Disease This article has an online supplement, which is accessible from this issues table of contents at Am J Respir Crit Care Med Vol 185, Iss. 9, pp 10041014, May 1, 2012Copyright 2012 by the American Thoracic SocietyDOI: 10.1164/rccm.201202-0320STInternet address: ,支气管肺泡灌洗液细胞成分,细胞成份： 上皮源肿瘤细胞：如癌细胞 上皮源非肿瘤细胞：如纤毛柱状上皮 造血淋巴组织肿瘤细胞：如淋巴瘤细胞、白血病细胞 造血淋巴组织非肿瘤细胞：如中性、淋巴、巨噬细胞 其它：如细菌、真菌、寄生虫、结晶,BALF细胞比例异常与常见肺疾病,巨噬细胞 纤毛柱状上皮,BALF,BALF 尘细胞、巨噬细胞,BALF 含铁血黄素细胞、巨噬细胞（瑞吉染色1000）,BALF 含铁血黄素染色阳性（特发性肺含铁血黄素沉着症）,BALF淋巴细胞,淋巴细胞增多,见于结节病、外源性过敏性肺泡炎、结核、金属（铍）中毒、药物、机会性感染、HIV等。,BALF 淋巴细胞增多,BALF 淋巴细胞增多,BALF中性粒细胞,中性粒细胞增多 ，见于纤维化性肺泡炎、风湿性疾病伴肺纤维化、感染、ARDS等。,BALF 中性粒细胞增多,BALF 中性粒细胞增多,BALF 嗜酸性粒细胞,嗜酸粒细胞增高，见于嗜酸粒细胞性肺病、寄生虫、 哮喘、药物、真菌感染等。,BALF 嗜酸性粒细胞增多（特发性嗜酸性粒细胞增多综合征）,BALF 嗜酸性粒细胞增多（嗜酸粒细胞性肺炎）,BALF 细菌和真菌,BALF中见细菌、真菌是诊断细菌、真菌感染的直接证据。,BALF 细菌（细菌性肺炎）,BALF 真菌（肺曲菌病）,BALF 癌细胞 肺癌,d，e肺泡灌洗液经瑞-吉染色后镜下可见嗜酸性粒细胞,a，b，c支气管肺泡灌洗液镜下查见肺吸虫虫卵,艾滋病BALF检出卡氏肺孢子菌,某男，34岁，活动后胸闷气急2月，伴发热2周，CT示双肺弥漫性浸润性改变，行纤维支气管镜检查，于右中叶行支气管肺泡灌洗。BALF常规检验，呈灰白色，浑浊，蛋白阳性+，有絮状凝块。沉淀物涂片，瑞吉染色镜检分类，N2%,L1%，M67%,纤毛柱状上皮30%。涂片全片观察查见卡氏肺孢子菌。血HIV抗体检测，初筛与确认试验结果均为阳性。最后诊断（1）双肺重症卡氏肺孢子菌肺炎;（2）艾滋病,BALF涂片 卡氏肺孢子菌 BALF涂片 卡氏肺孢子菌 （瑞吉染色1000） （六亚甲基四胺银染色1000 ）,艾滋病BALF检出卡氏肺孢子菌,BALF涂片 卡氏肺孢子菌 BALF涂片 巨噬细胞 斑片云雾状分布 纤毛柱状上皮 （瑞吉染色1000） （瑞吉染色1000),患者陆某女、36岁，确诊非霍奇金淋巴瘤5个月，反复发热12天入院。患者缘于2013年7月初下腹部剧痛起病，当地医院腹部CT示小肠占位，遂于7月26日全麻下行部分小肠切除术，术后病理及免疫组化明确诊断NHL。术后化疗5个疗程，第5疗程期间出现高热，体温波动于39 -40.3 。胸部CT示双肺间质性肺炎。肺泡灌洗液常规检查：涂片（瑞吉染色）查见卡氏肺孢子菌及淋巴瘤细胞。该病人为NHL术后病人，接受多次化疗，患者免疫功能减低，罹患卡氏肺孢子菌肺炎（PCP）。经治疗患者病情好转。,淋巴瘤 BALF检出卡氏肺孢子菌及淋巴瘤细胞,BALF涂片 卡氏肺孢子菌 滋养体,BALF淡红色、浑浊、蛋白+，细胞总数2240106 /L、有核细胞数320106 /L分类：N15%、L50%、M34%、纤毛柱状上皮1%，查见卡氏肺孢子菌（大量）、全片观察可见淋巴瘤细胞。,BALF涂片 卡氏肺孢子菌 滋养体 （瑞吉染色1000）,BALF涂片 卡氏肺孢子菌 滋养体 （瑞吉染色1000）,BALF 淋巴瘤细胞,胸部CT治疗前后对比,治疗前,治疗后,卡氏肺孢子菌,卡氏肺孢子菌广泛存在于人和其他动物肺组织内，是机会致病性病原菌，引起肺孢子菌性肺炎（PCP)。是致免疫功能低下患者死亡的重要原因之一。如，艾滋病，器官移植，恶性肿瘤等。艾滋病感染卡氏肺孢子菌病（PCP）。文献报道艾滋病感染PCP几率可达90-100%。器官移植术后感染PCP，如未加预防感染几率可达10-15%。淋巴瘤化疗后,感染PCP，少见报道。PCP患者BALF及TBLB卡氏肺孢子菌检出率69-95%。,卡氏肺孢子菌形态： 滋养体、包囊,瑞吉染色 滋养体 ：形态呈圆、椭圆或不规则形，直径约2-5 m，胞质呈灰蓝至蓝色，核紫红色。滋养体多呈云絮斑片状。 包囊 ：直径约5-12 m，形态呈圆、类圆形，囊壁不着色，囊内见4-8个囊内小体，呈玫瑰花状或不规则排列。每个囊内小体含1个核，呈紫红色。囊内小体胞质染浅蓝色，不易观察。在BALF涂片中常呈斑片状分布。环六亚甲基四胺银染色（GMS） 包囊壁呈黑色深染的轮廓，其囊内小体模糊不清或隐约可见，部分包囊内呈括弧样结构。滋养体不着色亚甲胺蓝染色（TBO)包囊壁呈紫蓝色，囊内小体不着色，背景淡蓝色。,提高卡氏肺孢子菌检出率,免疫功能低下相关疾病的BALF标本临床怀疑PCP，要求查找卡氏肺孢子菌标本外观呈白色-灰白色，微浊-浑浊，有絮状物离心，取沉渣及絮状物制片，推片法制6张涂片，瑞-吉染色形态学观察：先低倍镜扫描，寻找斑片云雾状分布的不规则团块，此团块通常是由滋养体及包囊聚集而成，呈灰蓝色或灰红色，调节小螺旋可见许多针尖样大小的紫红色或紫灰色颗粒，分布于团块之中；再用油镜进行形态学辨认鉴定对卡氏肺孢子菌的包囊、滋养体形态特点要熟悉,五、体液自动化、标准化探讨,WS/T 406-2012临床血液学检验常规项目分析质量要求WS/T 347-2011血细胞分析的校正指南WS/T 359-2011血浆凝固实验血液标本的采集及处理指南WS/T 408-2012临床化学设备线性评价指南WS/T 405-2012血细胞分析参考区间ECLM:2000 欧洲尿液分析指南CLSI GP16-A3:2009尿液分析CLSI H26-A2:2010自动血液分析仪确认、验证和质量保证,国内临床血液体液专业规范性引用文件,体液检查标准化文件,国外: CLSIIFCC C49-A Analysis of body fluids in clinical chemistry, approved guideline（2007） 国外: CLSIIFCC H56-A Body fluid analysis for cellular composition (in Lab Hematology); approvedguideline （2006）,CLSIIFCC H56-A,Body fluid analysis for cellular composition (in Lab Hematology); approved guideline （2006）,标本种类：脑脊液、胸水、腹水、心包液、腹膜冲洗液 腹膜透析液、滑膜液、支气管肺泡灌洗液标本采集、处理、运输细胞定量检测形态学分析其它检查：免疫细胞化学、流式细胞仪、细胞遗传学分析后标本贮存,自动化体液细胞分析仪,自动化体液细胞分析仪性能,迈瑞流水线,迈瑞检测原理,检测通道,检测原理,报告参数,研究参数,DIFF,RBC