HIV实验室检测及规范操作

HIV实验室检测及规范操作 xxx 艾滋病检测的方法 HIV抗体检测HIV抗体初筛检测HIV抗体确认检测 免疫印迹试验 HIV核酸检测 核酸序列依赖性扩增 NASBA HIV定量逆转录PCR系统 RT PCR HIVRNA定量检测的分支测定法 bDNA 艾滋病检测方法的意义 HIV抗体检测酶联免疫吸附试验 间接法 直接法 双抗原夹心法 抗体竞争法明胶颗粒凝集试验 PA 快速法HIV AIDS的筛查 但初筛阳性结果不能做为艾滋病诊断依据 需将该标本送地区筛查中心实验室用两种方法进行复核 仍为阳性或一阴一阳则须送省确认中心 艾滋病检测方法的意义 HIV抗体确认检测 免疫印迹试验 HIV AIDS诊断的唯一依据 省CDC确认实验室负责全省监测哨点以及常规检测中阳性及可疑标本的确认和省内HIV初筛实验室的质量管理 另外 省检疫系统有一个确认实验室 设在省检疫局保健中心 艾滋病检测方法的意义HIV核酸检测 辅助诊断 在特殊情况下 如出现某些非典型的抗体反应 特别是不确定反应时 RNA的测定可提供有用的证据 感染早期 在HIV感染的窗口期 无法使用抗体检测进行诊断 此时RNA的测定具有特殊的意义 提示是否有感染的可能 但仍需追踪检测HIV抗体 最终根据抗体的检测情况做出诊断 病程监控 帮助确定疾病发展的阶段 指导治疗方案及疗效测定 预测疾病进程 国家对HIV抗体检测试剂的要求 初筛试剂筛查试剂必须是HIV1 2混合型的 经国家食品药品监督管理局注册批准 批批检合格 临床评估质量优良 在有效期内的试剂 确认试剂必须经国家食品药品监督管理局注册批准 我国常用的HIV抗体检测试剂 HIV抗体筛查试剂 酶联免疫 初筛实验室的常用基本试剂 明胶颗粒凝集 其它快速诊断试剂 在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区由经过培训的技术人员在规定的场所使用 HIV抗体确认试剂 免疫印迹试剂 快速检测试剂的优缺点 硒标记法和金标记法与ELISA相比 优点所需时间短操作简便 不需特殊设备 试剂贮存于室温 缺点特异性和敏感性与ELISA有差距 费用较高 HIV抗体检测程序及流程图 1 筛查试验标本验收合格后 用筛查试剂进行检测 如呈阴性反应 报告为HIV抗体阴性 对呈阳性反应的标本须进行重复检测 2 重复检测用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测 如两种试剂复测均呈阴性反应 则报告HIV抗体阴性 如均呈阳性反应 或一阴一阳 需送艾滋病确认实验室进行确认 3 筛查试验的流程图 样品 筛查检测 筛查试剂 阳性反应 重复检测 均阳性反应 一阴一阳 送确认实验室进行确认 均阴性反应 阴性报告 阴性反应 原有试剂加另一种筛查试剂 HIV抗体筛查结果的报告和处理 筛查试验呈阴性反应 出具HIV抗体阴性报告 提示应考虑窗口期的可能 筛查试验呈阳性反应 可出具 HIV待复查 报告 不能出阳性报告 同时尽快进行以下处理 填写HIV阳性标本送检单 并随标本送至当地筛查中心实验室 或直接送确认实验室 筛查中心实验室应尽快用两种试剂进行复测 如结果均阳性或一阴一阳 则应将该标本和送检单一并送至省艾滋病确认实验室确认 阳性标本必须送省确认中心 筛查实验室不能随意处理 做好检测后的咨询 结果的解释问题 HIV抗体检测结果阴性是否表明未感染 对不确定结果如何解释 怎么样知道婴儿是否感染了HIV HIV抗体初筛检测结果解释 阴性 1 未感染HIV 2 可能感染了HIV 但处于窗口期 或HIV 1 2抗体和HIV 1O亚型抗体低于检测下限 3 疾病晚期 免疫功能缺损 抗体可能呈阴性 确认阳性感染了HIV 样品含有HIV 1 2抗体和HIV 1O亚型抗体 未满18个月的婴儿除外 不确定 建议追踪检测 HIV抗体初筛检测结果解释 什么是不确定结果 HIV抗体确认试验时 试验条带上出现的蛋白带型不足以判断为HIV抗体阳性 应建议其3个月后复查 如果复查结果阳转 表明受检者已感染HIV 如复查时条带全部消失 则为阴性结果 如复查时条带没有变化或有变化但仍不足以判断为阳性 则应建议其3个月后再复查一次 如还不能判断为阳性结果 则应作为阴性对待 HIV抗体初筛检测结果解释 造成检测结果不确定的原因 1 处于窗口期 血清中还没有形成典型的HIV抗体 2 艾滋病进展到终末期 人体免疫力缺陷 抗体水平下降 3 与其他非病毒蛋白抗体有交叉反应 自身免疫性疾病 恶性肿瘤 怀孕 输血或器官移殖等 此时 身体产生的一些抗体与 核心蛋白抗体相似 4 以前接种过HIV疫苗 HIV抗体初筛检测结果解释 如何判断婴儿是否感染了HIV 通过胎盘 感染了HIV的母亲所生的婴儿可能带有来自母体的HIV抗体 此时HIV抗体检测阳性并不意味着已被感染 建议在婴儿9个月时进行HIV初筛检测如阴性 则判定为未感染HIV 如阳性 则应在婴儿18个月时进行复检阴性 判定为未感染 阳性 则将血样送至省CDC确认中心进行HIV抗体的确认试验 HIV抗体初筛检测 酶联免疫吸附试验 enzymelinkedimmunosorbentassay ELISA ELISA法中有间接法 夹心法和竞争法 目前使用最多的是夹心法 HIV抗体初筛检测 ELISA实验原理 酶球 酶标记抗原 抗体 HIV抗体初筛检测ELISA夹心法 原理将HIV抗原包被到固相载体上 标本中的HIV抗体与包被的HIV抗原结合形成复合物 利用抗体的多价性 又与酶 HRP 标记的同类HIV抗原也即酶标板内的球状复合物 形成一个HIV抗原抗体酶标记的HIV抗原复合物 最后加入底物 避光30分钟 在酶作用下 产生显色反应 加2N硫酸终止后呈黄色 在450 620nm双波长下测定光密度值 与标准进行比较 以判定标本的结果 HIV抗体初筛检测 材料标本 试剂盒 酶标仪和洗板机 其它试验基本材料 方法以荷兰阿克苏试剂盒为例 实验前试剂应在室温下放置30分钟 使用后试剂放回2 8 配制洗液1 25洗液用蒸馏水1 25稀释 稀释后可在2 8 稳定2周 TMB与尿过氧化物溶液等量混合准备成TMB底物 因其稳定性有限 所以应现用现配 配制后的TMB底物为无色 在避光下可以稳定6个小时 HIV抗体初筛检测 阿克苏ELISA 每孔加入100ul血清稀释液 注意不准碰到孔内的酶球 在所确定的孔中加入50ul血清标本或对照 设3孔阴性 1孔HIV 1阳性 1孔HIV 2阳性对照 混匀 盖上贴膜放入37 环境孵育1小时 孵育结束前5分钟 准备充足的TMB底物液 撕去贴膜 用新配制洗涤液洗板 洗板次数根据试剂盒要求 吸干 每孔加入100ulTMB底物液 置室温 18 25 闭光孵育30分钟 每孔加入100ul2N硫酸终止反应 在450nm 单波长 或450 620nm 双波长 读取光密度值 OD值 应在终止反应2小时内进行读数 HIV抗体初筛检测 阿克苏ELISA 结果判定 阴性对照 NegativeControl NC 的参考标准NC必须 0 250 去除 0 250的各孔 计算剩余NC的平均值 NCx 0 6NCx NC 1 4NCX 如果有一个以上超出此范围 去除后重新计算NCx 判定实验有效性 至少有2个阴性对照OD值有效 PC1 NCx 0 400 PC1 HIV 1抗体阳性对照值 PC2 NCx 0 400 PC2 HIV 2抗体阳性对照值 HIV抗体初筛检测 阿克苏ELISA 临界值 Cutoff 如果实验有效 按照公式计算界限值 Cutoff NCx 0 100 实验结果判定如果OD值 Cutoff值 则样品为阳性 如果OD值 Cutoff值 则样品为阴性 HIV抗体初筛检测 阿克苏ELISA 计算举例NC 0 089 0 093 0 091PC1 1 155PC2 1 069NCx 0 091清除异常的质控对照去除NC 0 250 无去除去除NC 1 4NCx1 4 0 091 0 127无去除去除NC 0 6NCx0 6 0 091 0 055无去除确定下列条件满足PC1 NCx 0 4001 155 0 091 1 064通过PC2 NCx 0 4001 069 0 091 0 987通过计算临界值Cutoff NCx 0 100 0 091 0 100 0 191 HIV抗体初筛检测 阿克苏ELISA 注意事项 超过有效期的试剂不能使用 样品和试剂应处于室温 使用后试剂放回2 8 为了避免污染 不要用手指或加样器尖接触酶标板孔及孔内的酶复合物 所有的加样步骤要精心准确 试剂或样品的交叉污染会引起错误的结果 避免微生物或其它污染物污染 清除酶标板孔内的气泡 如果需要 轻轻拍打板架 洗板机要经常保养 避免交叉污染 HIV抗体初筛检测 阿克苏ELISA 非重复有活性反应结果 假阳性 可能属于下列一个或多个技术问题引起 由于仪器或加样器尖造成的交叉污染 底物被金属离子污染 由于潮湿或试剂滴漏造成的交叉污染 不充分的洗板或最后吸去不彻底 读数错误 在酶标板底部有水滴或在酶标板孔内有气泡 HIV抗体检测 明胶颗粒凝集试验 gelatinparticleagglutination PA 以日本富士药厂和珠海丽珠试剂厂生产的试剂盒为例原理经HIV抗原致敏的明胶颗粒与血清中的抗体发生特异性抗原 抗体结合并产生肉眼可见的凝集反应 优点操作简便 快速 无需特殊仪器设备 适合门诊少量标本的检测 HIV抗体检测 明胶颗粒凝集试验 材料血清标本 U型板 PA试剂盒 A 溶解用液 B 血清稀释液 C 致敏颗粒 D 非致敏颗粒 阳性对照血清 专用滴管 方法 1 从4 冰箱取出试剂盒 恢复至室温后使用 2 从1 4开始做倍比稀释 3 用专用滴管 第二孔加1滴 25ul 非致敏颗粒 D 第三孔加1滴 25ul 致敏颗粒 C 4 轻轻拍打微量板或在振荡器上振荡1分钟混合后 室温 20 静置2小时后观察结果 HIV抗体检测 明胶颗粒凝集试验 结果判断明胶颗粒沉积在孔底 周边平滑 或形成致密圆圈者为阴性结果 明胶颗粒沉积在孔底 中央形成致密小环 周边平滑为可疑反应 孔内有清晰的宽环且外缘粗糙者 为阳性结果 孔内凝聚颗粒形成均一的膜覆盖在整个孔底者为强阳性反应 孔内样品与致敏和非致敏颗粒均产生凝集者 则需作重吸收试验后进一步检测 确认试验的试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准 在有效期内的试剂 确认试验方法包括免疫印迹试验 WB 条带免疫试验 LIATEKHIV 放射免疫沉淀试验 RIPA 及免疫荧光试验 IFA 国内常用的确认试验方法是WB HIV抗体确认试验 确认检测流程有HIV 1 2混合型和单一的HIV 1或HIV 2型 先用HIV 1 2混合型试剂进行检测 如果呈阴性反应 则报告HIV抗体阴性 如果呈阳性反应 则报告HIV 1抗体阳性 如果不满足阳性标准 则判为HIV抗体检测结果不确定 如果出现HIV 2型的特异性指示条带 需用HIV 2型免疫印迹试剂再做HIV 2的抗体确认试验 呈阴性反应 报告HIV 2抗体阴性 呈阳性反应则报告HIV 2抗体血清学阳性 并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析 HIV抗体确认检测流程 艾滋病实验室诊断确认试验 蛋白印迹Western Blot 试验 原理病毒裂解物抗原经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 分离 然后将分离后的抗原转移 印迹 到硝酸纤维薄膜上 采用类似ELISA的技术 当样品中含有HIV抗体时 它和印迹在硝酸纤维薄膜上的病毒抗原相结合呈现肉眼可见的特异性带型 HIV 1型主要基因有 核蛋白带gag p17 18 p24 p55 酶蛋白带pol p31 p51 p66 外膜蛋白带env gp41 gp120 gp160 确认试验结果的判定下面是我国使用WB确认HIV感染的判定标准和判定结果的基本原则 在实际工作中还应参照所用试剂盒说明书综合判定 遇疑难情况应报上级实验室解决 HIV 1抗体阳性 至少有2条env带 gp41和gp160 gp120 出现 或至少1条env带和p24带同时出现 HIV 2抗体血清学阳性 同时符合以下2条标准可判为HIV 2抗体血清学阳性 1 符合WHO阳性判定标准 即出现至少2条env带 gp36和gp140 gp105 2 符合试剂盒提供的阳性判定标准 HIV抗体阴性 无HIV抗体特异带出现 HIV抗体不确定 出现HIV抗体特异带 但不足以判定阳性 HIV 1抗体特异带包括 env带gp160 gp120 gp41 gag带p55 p24 p17 或p18 pol带p66 或p65 p51 p31 HIV 2抗体特异条带包括 env带gp140 gp105 gp36 gag带p56 p26 p16 pol带p68 p53 p34 由于使用的毒株不同 HIV 2env带也可为gp125 gp80 gp36 HIV抗体确认试验结果报告确认试验由确认实验室根据检测结果出具 HIV抗体确认检测报告单 附表3 报告HIV抗体阳性 HIV抗体阴性 及HIV抗体不确定 符合HIV 1抗体阳性判断标准 报告 HIV 1抗体阳性 并按规定做好检测后咨询 保密和疫情报告工作 符合HIV抗体阴性判断标准 报告 HIV抗体阴性 如果近期有高危行为 如性乱 注射毒品等 或有急性流感样症状等情况 为排除因 窗口期 而出现的假阴性结果 建议高危行为后3个月时再做抗体检测 也可进行HIV 1P24抗原或HIV核酸检测 作为辅助诊断 符合HIV抗体不确定判断标准 报告 HIV抗体不确定 在备注中应注明 3个月后复检 同时进行以下处理 1 随访复检 每3个月随访复检1次 连续2次 共6个月 如果检测时暴露时间已超过3个月 则在3个月后随访1次即可 将前后2份样品同时检测 仍呈不确定或阴性则报告HIV抗体阴性 如果在随访期间发生带型进展 符合HIV抗体阳性判定标准则报告HIV 1或HIV 2抗体阳性 2 必要时可做HIV 1P24抗原或HIV核酸测定 但检测结果只能作为辅助诊断依据 确认报告要依据血清学随访结果 发出确认报告的同时要做好检测后咨询 HIV抗体确认报告由1名具有高级卫生技术职称的人员复核签字 按原送检程序反馈 如确认对象户口不属于本辖区 确认报告应同时抄送HIV感染者户口所在地的省艾滋病确认中心实验室 其它系统确认的地方人员 包括本地和外地 也应及时向当地卫生行政部门和省艾滋病确认中心实验室报告 省艾滋病确认中心实验室难以确认的样品 送国家艾滋病参比实验室确认 同一受检对象的样品在不同实验室得到不一致的确认结果时 由国家艾滋病参比实验室和艾滋病确认实验室审评及技术指导专家组予以仲裁 HIV检测的规范操作要求HIV检测不同于其他病原微生物检测 要求十分严格 任何错误的诊断 包括假阳性或假阴性 都会对被检者产生十分重要的影响 因此 HIV检测 必须严格按照国家制定的检测工作规范进行 整个实验过程应有严格的质量保证体系 HIV抗体检测的规范操作要求 标本的采集 血清样品的采集用注射器抽出一定量静脉血 室温下自然放置1 2小时 待血液凝固后再用3000rpm离心15分钟 吸出血清备用 抗凝血标本的采集用加抗凝剂的真空采血管或用消毒注射器抽取静脉血 转移至加有抗凝剂的试管 反复轻摇 分离血浆和血细胞 根据实验要求选用适当的抗凝剂 常用EDTA 如需进行病毒RNA测定 应在4 8小时以内分离标本 应按临床采血技术规范要求 做好个人防护 HIV抗体检测的规范操作要求 样品的保存 用于抗体检测的血清或血浆样品应存放于 20 以下 短期 1周 内进行检测的样品可存放于2 8 用于抗原和核酸检测的血浆和血细胞样品 应冻存于 20 以下 长期保存 3个月以上 应置于 70 用于病毒载量测定的血浆标本应于采血后4 8小时内置于 70 保存 HIV抗体检测的规范操作要求 样品的运送 实验室间传递的样品应为血清或血浆 除特殊需要外 不能用全血 管壁上有明显的标记 编号或姓名 并附有阳性送检单 送检单应与标本分开 不能混放 标本应置于带有盖帽的试管内 避免碰碎 防止样品流出 路途较远或者气候炎热时 应在2 8 条件下运送 用于抗体检测的样品可在短期内 48小时内 室温递送 特殊情况下可以用特快专递形式投寄 但应保证不会破碎和溢漏 HIV抗体检测的规范操作要求 样品的接收 含有感染性样品的包装应进行消毒 核对标本与送检单 检查样品管有无破损和溢漏 如发现溢漏 应立即进行相应处理并报告有关领导和专家 检查样品的状况 记录有无严重溶血 微生物污染等情况 HIV抗体检测的规范操作要求 样品的检测 严格按 全国艾滋病检测技术规范 要求进行 严格按试剂说明书操作 不得擅自更改 严格遵守实验室操作规程 注意防止交叉污染 检测程序及流程图 检测结果的报告与处理 艾滋病检测实验室安全防护 建立安全制度 实验室的设备 建筑和设施的安全性应通过专家的评审 实验室墙面 地面 台面材料应耐酸 耐碱 易清洁消毒 不渗漏液体 室内应有防蚊 防蝇 防鼠等设备 有条件的实验室应装有脚踏或感应流水装置 实验室应装置恒温设备 室温保持在20 25 2 建立适用于现有实验条件的安全标准操作程序 3 每年对安全标准程序及其实施情况进行检查 4制定意外事故处理预案 建立意外事故的记录和报告制度 及时对突发事件和职业暴露事故进行调查 处理和报告 艾滋病检测实验室安全防护 人员管理和培训 人员管理 对实验室环境进行安全检查 新调入人员 外来合作 进修和学习的人员进入实验室需经过许可 非实验室人员和非实验室物品不得进入实验室 严格执行实验室工作人员年度采血检测HIV抗体和备案制度 工作人员血清应长期保存 培训 所有工作