《基因组研究技术》PPT课件

第十二章基因组研究技术 基因组一词 genome 系由德国汉堡大学植物学教授汉斯 温克勒于1920年首创一个生物的基因组蕴含了该生物体全部的遗传信息 即为整套染色体所含有的全部DNA序列现代基因组测序技术迅猛发展 已产生许多物种庞大的基因组序列信息基因组学 genomics 以基因组序列数据为出发点 从整体水平上研究基因的存在 结构与功能 基因间相互关系 甚至于染色体分子水平的结构特征以及不同物种基因组之间的进化关系等 最终系统地解码生命 第一节传统基因组研究技术 在基因组学新兴之初 获得生物体基因组DNA序列是研究关注的焦点基因组测序基本策略 整个基因组DNA随机打断 各小片段逐一测序 按位置关系排列组装各测序小片段基因组图谱精确指导测序拼接 遗传图谱 物理图谱 序列图谱和功能图谱 一 基因组遗传图谱的构建 遗传作图 geneticmapping 是对某个未知真核生物基因组中的遗传信息 或者是控制某个性状的基因 在染色体上的位置和分布状况进行初步确定 1 遗传作图标记 标记 位于染色体上易于检测识别个体间多态性稳定遗传 形态标记DNA标记限制性酶切片段长度多态性 RFLP 简单序列长度多态性 SSLP 单核苷酸多态性 SNP 2 遗传作图的方法 1 遗传作图的遗传学原理孟德尔遗传学的连锁和交换定律基因交换频率与在染色体上的间隔距离成正比利用重组率判断基因在染色体上相对位置 2 不同模式生物的连锁分析有性杂交实验连锁分析系谱分析作图细菌 无减数分裂 转化 转导和结合转移频率 二 基因组物理图谱的构建 遗传图的分辨率有限遗传图的覆盖面较低遗传分子标记排列有时会出错 1 限制性作图在基因组上标定限制性酶切位点的相对位置主要适合对小基因组的原核生物和大片段进行限制性位点分析 2 DNA大片段重叠克隆的基因组作图先构建基因组的大片段基因文库然后根据克隆片段之间的重叠顺序构建重叠群 contig 从而绘制物理连锁图 3 荧光标记原位杂交作图fluorescentinsituhybridzation FISH通过荧光标记的探针与染色体杂交 从而确定分子标记在染色体上的实际物理位置 4 序列标签位点作图sequencetaggedsite STS通过PCR或分子杂交将序列标签小段DNA序列在基因组DNA中进行定位可用于构建最为详细的大基因组物理图 5 基因组光学图谱 OpGen公司开发光学图谱 来源于细菌 酵母或者真菌的单个基因组DNA分子有序 高信息含量的限制性酶切位点的图谱做法 1 温和裂解细胞 抽提长的基因组DNA分子 2 微流体装置将单个DNA分子在光学芯片上锚成平行阵列 3 原位限制性消化锚定DNA分子并染色 4 分析软件测量酶切产生片段大小和顺序 5 光信号转换成数字信号 获得单分子光学图谱 三 基因组测序 1 大规模基因组测序方法学改进454测序技术 Solexa测序技术 SOLiD测序技术和单分子测序技术 具体测序原理见第九章 2 基因组DNA序列的确定 1 通过鸟枪法拼接序列染色体DNA随机打断成小片段 测序小片段 检测短序列间可能的重叠区 逐级拼接 推导出完整序列 2 克隆重叠群法测序技术在鸟枪法基础上发展起来 3 人类基因组测序 人类基因组计划1999年正式实施 2003年全部完成 国际人类基因组测序协调组 图谱测序方法 物理图谱 鸟枪法 美国CeleraGenomics公司 全基因组鸟枪法 两种测序结果和分析 2001年发表在Nature和Science杂志上 第二节现代基因组研究技术 随着生命科学领域技术的飞速发展 只停留在传统基因组学时代里获得生物全基因组序列 重点关注单个或少数基因表达调控 已满足不了科学发展的需要后基因组时代使命 把一个基因组或一类基因组作为一个独立单位 来研究众多基因是如何精妙地组织构成基因组 基因组之间的进化关系和演化方向以及基因组仅靠静态的核酸序列是如何在瞬息万变中有条不紊地指挥生命的 一 基因组序列的解读 1 通过序列分析查找基因 寻找基因的开放阅读框Getorf FASTA输入格式http bioweb pasteur fr seqanal interfaces getorf html 借助序列的同源性寻找基因常用软件 TWINSCAN Korf 等 2001 和SGP2 syntenicgenepredictiontool ParraG等 2003 2 确定基因的实验技术 分子杂交检验某一片段是否含有表达序列DNA mRNA的杂交分析 Northern杂交 EST和cDNA测序有助于鉴定基因 确定转录物末端cDNA末端快速扩增 rapidamplificationofcDNAend RACE 异源双链分析 外显子捕获 二 基因功能的预测和验证 1 利用生物信息学分析基因功能同源性检索 利用氨基酸序列进行同源性检索得到的假阳性可能会较少BLAST Basiclocalalignmentsequencetool 2 用实验手段确定基因功能反向遗传学 基因失活基因敲除 T DNA插入突变体库 RNA干扰 反义RNA等 基因超量表达探索基因功能overexpression 目的基因异源表达3 基因编码的蛋白质功能的深入研究定点诱变 报告基因和免疫细胞化学 噬菌体表面展示 酵母双杂交等 三 功能基因学研究技术 单一基因或蛋白的研究 多基因或蛋白系统研究 基因组或系统水平上 功能基因组学 后基因组学 1 转录组学相关研究技术基因的表达谱能显示基因在细胞中的作用 也能帮助鉴定它与其他基因在功能上的联系用于全局分析基因表达情况的技术 1 cDNA AFLP cDNA amplifiedfragmentlengthpolymorphism 2 差异显示PCR differentialdisplayreversetranscriptionPCR DDRT PCR 3 抑制性扣除杂交 suppressionsubtractivehybridization SSH 4 基因表达系统分析 serialanalysisofgeneexpression SAGE 5 微阵列技术 microarray 6 转录组测序技术2 蛋白质组学相关研究技术蛋白质才是生物系统中最终端 最关键的成分 必须对蛋白质展开直接研究 1 双向凝胶电泳 twodimensionalgelelectrophoresis 2DGE 2 定量蛋白质组学技术 quantitativeproteomics 基于质谱技术的方法 同位素定量标记方法 iTRAQ 非标记定量方法 labelfree 3 蛋白质相互作用和相互作用组酵母双杂交技术 细菌双杂交技术 噬菌体表面展示技术 蛋白质芯片技术 3 代谢组学相关研究技术对某一生物或细胞所有低相对分子量代谢产物进行定性和定量分析代谢组的分析技术包括 化合物的分离气相色谱 gaschromatography GC 液相色谱 liquidchromatography LC 毛细管电泳 capillaryelectrophoresis CE 等检测及鉴定技术质谱 光谱 核磁共振 电化学等 4 基因组学研究展望编码序列仅占全基因组1 2 剩下基因组99 的序列一无所知 可能蕴藏新式遗传语言2011年 首次绘制出了人类基因组的3D图谱染色体互作 染色体架构 基因表达调控更高级模式立体化高级基因组遗传语言 阐明生命本质 第三节基因组工程 一 基因工程与基因组工程 切割 重组遗传基因 人为期望产物新遗传特征的生物类型 基因工程 基因组工程 达到相应目的 大片段基因 簇 功能分析去除非必需遗传区域染色体可控重组 1 操作的基因和载体基因工程 质粒和病毒载体kb级工程性遗传操作基因组工程 人工染色体Mb级工程性遗传操作2 克隆和扩增的宿主基因工程 细菌 大肠杆菌 枯草芽胞杆菌 真菌 酵母 动植物细胞 昆虫细胞 哺乳类细胞 基因组工程 可以细菌 真菌 动植物细胞为宿主 但主要以酵母和哺乳类培养细胞为主3 工程性遗传操作手段4 产物检测基因工程 限制性酶切图谱 southern杂交 northern杂交 PCR等分析基因表达情况 蛋白分析 酶学分析 免疫分析等研究其表达产物基因组工程 高通量手段 如生物芯片 二 基因组工程研究中的遗传同源重组系统 1 基于Cre loxP重组系统的基因组工程 重组酶 Cre重组位点 loxPCre介导 同向loxP切除中间部分反向loxP导致倒位 2 基于Red ET重组系统的基因组工程 重组酶 Red Red Red 或Rede RedT重组位点 短同源臂 35 50bp 3 TALEN靶向基因组编辑技术 4 基于Cas9核酸酶和sgRNA导向的CRISPR基因组编辑技术clusteredregularlyinte