实验 植物DNA提取及检测ppt课件

植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测 一 实验目的 学习提取和纯化高等植物总DNA的方法 理解其原理 脱氧核糖核酸 DNA 核糖核酸 RNA 与蛋白质结合在一起以核蛋白 DNP 的形式存在 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA 前者存在于细胞核内 后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内 例如线粒体DNA mtDNA 和叶绿体DNA ctDNA 二 实验原理 细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸 基本过程 机械方法 超声波处理法 研磨法 匀浆法 化学试剂法 用SDS处理细胞 酶解法 加入溶菌酶或蜗牛酶 破坏细胞壁 细胞破碎 SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合 SDS能够破坏这种价键 CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂 它可以溶解膜与脂膜 使细胞中的DNA 蛋白质复合物释放出来 并使蛋白质变性 使DNA与蛋白质分离 DNA提取 蛋白质常用苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 或氯仿 异戊醇 24 1 抽提 RNA常选用RNase消化 或是用LiCl来消除大分子的RNA 酚类物质提取液中加少量巯基乙醇 选取幼嫩的材料 DNA纯化 去杂质 实验材料植物叶片 去叶脉 试剂2 CTAB抽提液 CTAB Tris HCL EDTA Nacl TE缓冲液 pH 8 0 氯仿 异戊醇 24 1 巯基乙醇异丙醇70 乙醇 三 材料与试剂 离心机 水浴锅 研钵 微量移液器 仪器用具 移液器 量程的选择 1 取2g清洗凉干的植物幼嫩叶片于研钵中 加入液氮 迅速研磨 将2 CTAB抽提液与2ml巯基乙醇在提取前混合后于65 水浴中加热30分钟 2 将0 5mL研磨液转入1 5mL离心管中 加入1mlCTAB提取液 置于65 水浴中保温30min 其间颠倒混匀2 3次 破碎细胞3 加入等体积氯仿 异戊醇 24 1 混合液 充分颠倒混匀20分钟 防止成团 8000r min 离心5min 取上清 抽提去蛋白4 将上清液移入新的1 5mL离心管内 加等体积异丙醇 预冷 颠倒混匀 可见DNA絮状沉淀 沉淀核酸5 8000r min 离心1min 倒掉上清液 将离心管倒置干燥 将沉淀回溶于无菌水或TE缓冲液待测 四 操作步骤 1 选取新鲜材料 研磨迅速彻底 研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀 2 若提取产物有颜色 可能是材料中含有较多的多酚类物质 添加巯基乙醇 2 5 尽可能选取幼嫩的材料 3 收集CTAB与核酸形成的复合物时不要离心过度 否则沉淀再溶解难 4 为了获得具有生物活性的天然核酸 在分离制备过程中必须采用温和的条件 避免过酸过碱 剧烈地搅拌 防止热变性 同时还要避免核酸降解酶类的降解 五 注意事项 六 作业 为了获得高质量的植物总DNA 在分离提取过程中应注意那些问题 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一 实验目的学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 在一定电场强度下 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比 二 实验原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力就越强 三 实验仪器和试剂 仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等 Tris 硼酸 TBE Tris 乙酸 TAE Tris 磷酸 TPE 常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色 一般与蔗糖 甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液 作用 增加样品比重 以确保DNA均匀沉入加样孔内 形成肉眼可见的指示带 预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色 使加样操作更方便 上样缓冲液 溴化乙锭 EB 是一种荧光染料 EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出红色荧光 其荧光强度与DNA的含量成正比 据此可粗略估计样品DNA浓度 琼脂糖凝胶EB染色 肉眼可见核酸电泳带 其DNA量一般 5ng EB是致癌物质 切勿用手接触 更不要污染环境 GoldViewTM 是一种可代替溴化乙锭 EB 的新型核酸染料 采用琼脂糖电泳检测DNA时 GoldViewTM与核酸结合后能产生很强的荧光信号 其灵敏度与EB相当 使用方法与之完全相同 在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光 而单链DNA呈红色荧光 GoldView不仅能染DNA 也可用于染RNA 核酸染色剂 DNA分子量标准 不同种类DNAMarker 1 凝胶制备制备1 琼脂糖凝胶 称取0 8g琼脂糖加入80mL1 TAE 加热至琼脂糖全部熔化 冷却至50 60 时 加入EB或GoldViewTM10ul 缓慢倒入胶板 待胶凝固后拔出梳子 2 加样取15 lDNA样液与2 l上样buffeer混匀 用微量移液器小心加入样品槽 3