微生物的营养与生长

24 04 2020 1 第三章 微生物的营养与生长 24 04 2020 2 主要内容 微生物所需营养物质及其生理作用微生物的营养类型及特点微生物对营养物质的吸收方式 特点微生物生长的概念及其测定微生物的生长曲线及在食品工业中应用环境因子对微生物生长繁殖的影响微生物的培养基 培养方法与设备 24 04 2020 3 第一节 微生物的营养 24 04 2020 4 一 微生物细胞的化学成分水 70 90 干物质 有机元素 C 50 H O 30 N 10 13 有机物 蛋白质 糖 脂类 核酸 维生素及其降解产物无机元素 常量元素 P K Ca Mg Fe 痕量元素 Cu Zn B Mo无机物 参与有机物组成 单独存在于细胞质内以无机盐的形式存在 24 04 2020 5 二 微生物所需营养物质及其生理作用营养物质 为生物自身合成 产生能量以及在代谢中起调节作用的物质 营养 机体吸收 利用营养物质的过程 根据营养成分 营养物质分为六种类型 C源 N源 能源 生长因素 无机盐 水分 24 04 2020 6 1 碳源 构成细胞物质及代谢产物中碳素来源的物质 作用 构成碳架来源与能源 约占细胞干物质的50 种类 有机含碳化合物 糖 醇类 有机酸类 碳氢化合物 CH4 石油及其产物无机含碳化合物 CO2 碳酸盐类 CN 24 04 2020 7 2 氮源 作用 构成细胞物质及代谢产物中氮素来源的物质 主要用于组成菌体的含氮物质 少数可作为能量 硝化细菌 种类 N2 NH3固氮菌 有机氮源 蛋白质 迟效氮源 氨基酸无机氮源 NO3 NH4等 速效氮源 24 04 2020 8 氨基酸自养型微生物 利用非AA类的简单氮源 尿素 NH4 NO3 自行合成所需要的一切AA 氨基酸异养型微生物 须从外界吸收现成的AA作为氮源的微生物 不论哪种状态的氮化物 都要首先转化成NH3再与有机酸结合转化成氨基酸 24 04 2020 9 3 矿素种类 大量元素 P S K Mg Ca Fe 95 微量元素 Zn Mo 功能 1 构成细胞的各种成分如 Mg 叶绿素的辅因子 Ca 蛋白酶 淀粉酶的辅因子 构成芽孢 2 调节细胞的渗透压 pH 氧化还原电位3 能源 Fe S等作为自养微生物的能源 24 04 2020 10 4 生长因子 微生物生长必不可少的微量有机物 如维生素 氨基酸 嘌呤 嘧啶 维生素 多为酶的组分如硫胺素 B1 核黄素 B2 FMN的前体 烟酸 NAD的前体 吡哆醇 B6 转氨酶辅基 泛酸 生物素 氨基酸 微生物合成氨基酸的能力随种类而不同 如大肠杆菌可合成全部 鼠伤寒沙门氏菌Tyr 肠膜明串珠菌合成氨基酸的能力弱 需补充19种氨基酸 碱基 核酸和辅酶的成分 24 04 2020 11 5 水 占细胞鲜重的70 90 功能 构成细胞组分 生化反应的介质 溶剂 热导体 维持细胞渗透压水分 自由水 能够被利用的水束缚水 与溶质结合构成细胞结构的水 不能被利用进行生命活动 24 04 2020 12 水分活度 在相同温度和压力下溶质的蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比 aw P溶质 P0微生物需要的aw值为0 63 0 99 细菌 酵母菌 霉菌 盐细菌 耐旱真菌 24 04 2020 13 三 微生物的营养类型及特点 划分依据 碳源 供氢体 能源根据碳源和供氢体的不同可分为有机营养型无机营养型 根据能源的不同可分为化能营养型光能营养型 24 04 2020 14 1 光能无机营养型能源 光 具光合色素 叶绿素 蓝细菌 或菌绿素 光合细菌 光合磷酸化产生ATP 供氢体 还原性无机化合物碳源 CO2 例1 蓝细菌 H2O CO2 CH2O O2供氢体碳源产氧型光合作用 24 04 2020 15 例2 绿硫细菌 紫硫细菌 H2S CO2 CH2O H2O SNaS2O3 CO2 H2O CH2O Na2SO4 H2SO4碳源供氢体细胞内或外积累硫 非产氧型光合作用VanNiel通式 CO2 H2A CH2O H2O A 24 04 2020 16 2 光能有机营养型能源 光碳源 二氧化碳或简单有机化合物供氢体 有机化合物例 红螺菌 CO2 异丙醇 CH2O 丙酮 H2O可利用净化有机废水 生产SCP 24 04 2020 17 3 化能无机营养型氢细菌 铁细菌 硫化细菌 硝化细菌等能源 还原态无机物氧化 NH3 NO2 H2 H2S S S2O3 Fe2 等 碳源 CO2 CO32 供氢体 无机化合物例1 氧化亚铁硫杆菌 Fe2 Fe3 e E 24 04 2020 18 例2 可用于细菌冶金 浸贫 尾矿 回收重金属如Cu原理 S O2 FeSO4 H2SO4 E氧化硫硫杆菌H2SO4 O2 FeSO4 Fe2 SO4 3 H2O氧化铁硫杆菌CuS 辉铜矿 Fe2 SO4 3 CuSO4 FeSO4 SCuSO4 Fe 废铁 Cu FeSO4例3 氢细菌 H2 1 2O2 H2O 56 2kcal例4 铁细菌 2Fe 1 4O2 2H 2Fe 1 2H2O 10 6kcalpH 01kcalpH 7 24 04 2020 19 4 化能异养型 碳源 能源 供氢体均为有机物必须以适宜的有机物为养料 大多数微生物为此类 分腐生 寄生 专性寄生 兼性寄生四种 上述四大类型划分不是绝对的 有许多中间类型 红螺菌 光能异养 有光 无氧时 化能异养 无光 无氧时 24 04 2020 20 微生物和动物 植物营养物质的比较 24 04 2020 22 四 微生物对营养物质的吸收方式 特点1 简单扩散 simplediffusion 一种物理扩散 动力 细胞膜两侧的浓度差 能量 不需 载体 不需 例 CO2 气体 水 小分子脂溶性 水溶性物质 大肠杆菌对Na 的吸收 24 04 2020 23 2 促进扩散 facilitateddiffusion 特点 不耗能 浓度差为动力 顺浓度梯度 有特异性 需载体参与 例 真核微生物运送糖 分别有葡萄糖载体 亮氨酸载体 异亮氨酸载体 24 04 2020 24 3 主动运输 activetransport 特点 需能 可逆浓度梯度运送物质需要载体运送前后底物无化学变化例 大肠杆菌运送乳糖 半乳糖 阿拉伯糖 氨基酸 K 使膜内 K 300膜外 K 24 04 2020 25 4 基团转位 grouptranslocation 特点 需能 逆浓度梯度 需载体 被运输底物运送前后发生化学变化 例 磷酸转移酶系统 PTS 对营养的吸收 1 系统组成 E1 E3 非特异性 细胞质内E2 诱导酶 特异性 如E2GluHpr heatstableprotein 2 过程 PEP Hpr P Hpr 丙酮酸 胞内 E1 糖 E2 糖 E2 膜上 P Hpr 糖 E2 糖 P Hpr E2 膜内侧 糖 P进入质 磷酸化后 细胞膜对底物不再渗透 防止流出胞外 24 04 2020 26 24 04 2020 27 第二节 微生物的生长 24 04 2020 28 主要内容 微生物的个体生长微生物群体生长环境因素对微生物生长的影响及其原理 24 04 2020 29 一 微生物生长的概念及其测定1 生长单细胞生物有机体细胞组分和结构在量的方面的增加 繁殖单细胞生物细胞数目的增多 多细胞生物通过形成有性 无性孢子使个体数目增多 发育从生长到繁殖 是生物的构造和机能从简单到复杂 从量变到质变的发展过程 这一过程称为发育 个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 个体生长 个体繁殖 24 04 2020 30 2 微生物计数法 直接计数计数器计数 血球计数板细菌计数板比例计数 菌液 血液 血液细胞数恒定 男400万 500万 mL 女350 400万 mL 电子自动计数器 比浊法 浓度与吸光度成正比 细胞干重 菌丝过滤测体积 24 04 2020 31 二 微生物生长的测定 群体生长 直接计数 血球计数板法 24 04 2020 32 间接计数 平皿菌落计数 24 04 2020 33 测定物质含量测定含氮量 蛋白质 N 6 25测定含碳量 生理指标 磷 DNA RNA ATP和N 乙酰胞壁酸等的含量 以及产酸 产气 产CO2 用标记葡萄糖作基质 耗氧 粘度和产热等指标 均可用于生长量的测定 24 04 2020 34 3 微生物个体生长的测定 电子显微镜观察 同步生长 培养基中的所有细菌处于细胞分裂的相同阶段 获取方法 诱导法 控制温度 营养 或加抑制剂使细胞同时开始生长 选择法 滤膜过滤 密度梯度离心 硝酸纤维素培养 等 意义 使群体中所有细胞尽可能处于同样的细胞生长和分裂周期中 从群体研究水平研究个体细胞的变化 24 04 2020 35 二 微生物的生长曲线及在食品工业中应用微生物群体生长细菌纯培养群体生长规律将少量单细胞纯培养接种到恒定容积的液体培养基中培养 定时取样计数 以培养时间为横坐标 细菌数的对数为纵坐标所绘制出的曲线 叫群体生长曲线 实际上是繁殖曲线 从群体研究上反映个体的状况 24 04 2020 36 细菌纯培养群体生长规律1 延迟期 lagphase 2 对数生长期 logphase expotentialphase 3 稳定期 stationaryphase 4 衰亡期 declinedphase 24 04 2020 37 1 延迟期 lagphase 特点 数目几乎不增加 或稍有减少 但细胞体积增长较快 代谢活跃 细胞内物质增加 对外界抗性下降 原因 调整代谢以适应新的环境条件 合成诱导酶 积累必要的中间产物等影响延迟期长短的因素 菌种 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短 接种物菌龄 用对数生长期的菌种接种时 其延迟期较短 甚至检查不到延迟期 接种量 一般来说 接种量增大可缩短甚至消除延迟期培养基成分 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延迟期比在合成培养基上生长时间短 接种后培养基成分有较大变化时 会使延迟期加长 所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近 缩短延迟期的措施 增加接种量采用最适菌龄加入某些成分选育繁殖快的菌种 24 04 2020 38 2 对数生长期 logphase expotentialphase 细菌特点 数以几何级数增加 A 增长速率常数R值最大 代时短 B 细胞进行平衡生长 菌体内各种成分最为均衡 C 酶系活跃 代谢旺盛 代时 generationtime G 单个细胞完成一次分裂所需时间 设n 分裂的代数 t0时细胞数x t1时细胞数y 则G t1 t0 nY 2n XG T1 T0 3 3 lgy lgx 24 04 2020 39 意义 是生理代谢及遗传研究或进行染色 形态观察的好材料 作为发酵种子接种 可以缩短延迟期 发酵工业上尽量延长该期 以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 影响代时的因素 A 菌种 B 营养成分 C 营养物浓度 影响速率与总生长量 D 培养温度 24 04 2020 40 3 稳定期 stationaryphase 现象 积累代谢产物 生长维持 细胞总量最大 原因 A 营养尤其是生长因子消耗 B 营养物比例失调 如C N比 C 酸 醇 毒素等有害代谢产物积累 D pH 氧化还原电位等物化条件越来越不适宜 24 04 2020 41 特点 A 增长速率常数R值为0 即死亡细胞数 新生的细胞数 B 细胞中开始贮存糖原 异染颗粒和脂肪等 C 开始形成芽孢 合成抗生素等次生代谢产物 工业应用 获取大量菌体或代谢产物 可以通过补料或调节pH值延长此时期 24 04 2020 42 4 衰亡期 declinedphase 生长出现负增长 即新生细胞数 死亡的细胞数 现象 形态多样 如菌体畸形等 有的微生物出现自溶 有的微生物开始产生或放出对人类有用的抗生素等次生代谢物 原因 生活环境越来越不利 研究的意义 预测达到的菌数 了解不同时期的差别 上述曲线适合无分枝微生物 丝状微生物液体搅拌培养时的生长繁殖类似细菌 24 04 2020 43 三 连续培养连续培养 continuousculture 又叫开放培养 是相对分批培养 batchculture 或叫密闭培养而言的 所谓分批培养是指将微生物接种于恒定容积的培养基中 经过培养生长 最后一次收获的培养方式 其生长类似于纯培养曲线 24 04 2020 44 连续培养 continuousculture 又叫开放培养 当微生物以单批培养的方式培养到指数期时 一方面以一定的速度连续流进新鲜培养基 并立即搅拌 利用溢流的方式 以同样的流速流出培养物 延长对数期 这样培养物就达到动态平衡 优点 取消时间间隙 缩短周期 便于自控 产品均一 缺点 易杂菌污染 菌种退化 24 04 2020 45 实现连续培养的方法 恒浊法 其原理是根据培养容器内微生物的生长密度 用光电系统来检测培养液的浊度 并进行控制的培养方法 恒化法 使培养液流速保持不变 微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的培养方法 主要用于实验室的科学研究中 24 04 2020 46 四 环境因素对微生物生长的影响几个概念 消毒 用较温和的理化因素 部分杀灭物体表面或内部微生物细胞尤其是杀灭病原微生物而对被消毒的物体基本无害的措施 防腐 就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖 从而达到防止食品等发生霉腐的措施 一旦抑制因素解除则微生物可恢复生长 灭菌 用较剧烈的理化因素使任何物体内外的一切微生物不可逆的丧失其生长繁殖能力的措施 商业无菌 指食品经杀菌处理后 按照规定的微生物学检验方法 在所检食品中无活的微生物检出 或仅能检验出极少的非病原微生物 且它们在食品保藏过程中不可能生长繁殖 24 04 2020 48 1 物理因素 温度 每种微生物细胞都有一定的生长温度范围 在此温度范围内温度越高生长速率越快 温度过低则原生质膜处于凝固状态 酶活被抑制 生命活动不能进行 过高则蛋白质 核酸 和其他成分不可逆变性失活 菌体死亡 24 04 2020 49 微生物的生长温度范围 最低最适最高专性嗜冷微生物 0 15 20 兼性嗜冷微生物 0 25 30 40 嗜中温微生物10 20 40 60 嗜热性微生物30 45 60 90 嗜高温微生物80 100 24 04 2020 50 原理 嗜冷微生物 酶活对高温敏感 30 40 酶活丧失 膜上不饱和脂肪酸含量高 嗜热微生物 酶抗热 含高浓度多胺核酸GC含量高膜含饱和直链脂肪酸合成速度快 弥补大分子的破坏 24 04 2020 51 高温消毒与灭菌致死温度 单位时间 通常10min 内杀死微生物的最低温度意义 决定灭菌温度方法 干热灭菌 灼烧 烘烤 160 170 2hr 湿热灭菌 巴斯德消毒法 小于100 15 30min 间隙灭菌 常压蒸汽反复灭菌 高压蒸汽灭菌 0 1Mpa 1 05kg cm2 121 15 30min 24 04 2020 52 低温冷藏冷冻 造就不利微生物生长的环境 保存菌种和食品等 如速冻食品 18 快速冷冻 采取速冻速融方法避免大的冰晶对食品细胞的伤害 利用反复冻融法制备细胞裂解液 24 04 2020 53 超声波 利用空化作用破坏细胞 氧浓度 24 04 2020 54 辐射 nm 1364008001000宇宙射线 xuv可见光红外线 大于1000nm无害 红外800 1000nm 光合细菌的能源 24 04 2020 55 可见光 400 800nm藻类的能源 强 长时间的可见光照射可造成光氧化作用 光线被色素吸收在有氧时酶和其他敏感成分失活 胡萝卜素在膜上阻止光到达细胞内 可保护细胞 UV非电离辐射 136 400nm 尤其在250 280nm的杀菌能力最强 原理 形成胸腺嘧啶二聚体 干扰核酸复制 可以光复活 二聚体被光复活酶结合的复合物在可见光下获光能解离成单体 O2 O3 臭氧 O2 O 新生态氧 杀菌 光氧化作用 H2O O2 H2O2 24 04 2020 56 电离辐射 x 射线 穿透力强 使环境和细胞中水分子吸收能量电离 产生自由基 与敏感分子反应使失活 低剂量引起生长和变异 高剂量引起死亡 H2O H2O e H OH H2O H OH O2 e O2O22 H2O使 SH氧化 酶变性 射线 强杀菌 强穿透力 可用于消毒 小剂量 500伦琴 可促进生长或诱发变异 大于10万伦琴杀伤力强 24 04 2020 57 24 04 2020 58 2 化学因子 pH值 一般生长范围在4 9间 少数种类在小于2 大于9生长 真菌pH范围广 如镰孢酶2 11 细菌 中性偏中性 例外 嗜酸性细菌如氧化硫硫杆菌1 5 嗜碱性细菌如巴氏芽孢杆菌11 2 11 9 通过控制H 进出细胞保持细胞的近中性环境 在培养基配制或发酵中通过调节酸 碱 加缓冲液使培养基保持恒定 24 04 2020 59 水分水活度 aw 细胞自由水与总水的比值aw P P0 自由水 自由水 结合水 渗透压盐0 85 左右 糖9 左右 过高 过低引起质壁分离或吸胀耐高渗微生物的筛选 24 04 2020 60 化学药剂无选择性 多外用 重金属盐 a 与带阴电荷的菌体蛋白结合使变性 Prt SH Hg2 Pro S Hg S 2H b 蛋白质沉淀剂 c 与代谢物相螯合如HgCl2 AgNO3 CuSO4 汞溴红有机化合物 醇 醛 酚 破坏细胞膜 细胞壁 使蛋白质变性 RNH2 HCHOR NH2 CH2O环氧乙烷 R SHR S CH2CH2OH氧化剂 高锰酸钾 过氧化氢 使 SH变成 S S 卤素 放出新生态氧 氧化杀菌 HClOHCl O 24 04 2020 61 抗生素与化学治疗剂 24 04 2020 62 培养基组分 营养物浓度 24 04 2020 63 第三节 微生物的培养基培养方法与设备 24 04 2020 64 概念 由人工配制的适合微生物生长繁殖和积累代谢产物的营养基质 24 04 2020 65 一 培养基配制原则1 根据微生物的营养要求配制2 注意各营养元素的配比浓度过低不能满足所需 过高则抑制生长 各营养物间的浓度配比影响到产物的形成和积累 如C N高 适合积累细胞 C N低 适合积累代谢产物3 渗透压 24 04 2020 66 4 pH值 不同类型微生物的最适pH范围不同 同一菌种最适生长pH和最适积累代谢产物pH可能不同 菌种代谢过程中产生代谢产物改变pH 通过加入缓冲剂 碳酸盐或直接添加酸碱调节 24 04 2020 67 5 Eh值 氧化还原电位 好氧性微生物 0 1厌氧性微生物 0 1好氧呼吸 0 1发酵或厌氧呼吸提高氧分压的方法 通气 加入氧化剂降低氧分压的方法 隔氧 通氮气 CO2 加入还原剂 24 04 2020 68 二 培养基的类型 1 按来源分 天然培养基 利用生物的组织 器官 细胞或抽提物为原料制成的培养基 合成培养基 由化学成分完全已知的物质配制成的培养基 半合成培养基 部分天然材料 部分化学试剂 24 04 2020 69 2 根据物理状态 有无凝固凝固剂及含量 1 液体培养基 成分基本溶于水 无明显固形物营养成分分布均匀 适合生理代谢及基本理论研究 及现代大规模发酵生产 2 固体培养基 A 固体物料 营养 盐等 如麸皮 马铃薯培养基 传统酿造法酿酒 醋等B 液体培养基 凝固剂 在实验室广泛用于微生物的分离 鉴定 检验杂菌 计数 保藏 生物测定等 3 半固体培养基 少量凝固剂 0 2 1 液体培养基 用于观察微生物的动力或保藏菌种 24 04 2020 70 凝固剂的条件 不被大多数微生物利用在微生物生长温度范围内保持固态耐高温透明度好黏着力强方便价廉 24 04 2020 71 常用凝固剂 琼脂 从红藻中提取的胶状物 由琼脂糖 琼脂凝胶组成 明胶 动物蛋白 硅胶 硅酸钠 硅酸钾盐酸 硫酸中和凝结成的胶体 不含有机物 适合分离培养自养微生物 其他 天然固体培养基 马铃薯 麸皮 米等 24 04 2020 72 两种凝固剂比较 琼脂明胶常用浓度1 5 2 5 12 熔点9628凝固点4520pH微酸酸微生物利用大多数不能许多能 24