实验6 微柱法分离测定糖化血红蛋白201X1109PPT课件

实验十微柱法分离测定糖化血红蛋白 一 目的要求 了解测定糖化血红蛋白的意义 掌握微柱法测定糖化血红蛋白的原理和实验技术 二 实验原理 葡萄糖可以和体内多种蛋白质中的氨基不可逆地以共价键结合 这个过程不需要酶的参与 其反应速度主要取决于葡萄糖的浓度 这种被葡萄糖糖化的蛋白主要存在于糖尿病或其他高血糖患者中 糖化过程通常缓慢地进行 一旦形成 不再解离 对血糖或尿糖波动较大的患者来说 采用糖化蛋白来诊断或追踪病情的发展具有独特的临床意义 它可以反映较长时期以来的平均血糖浓度 二 实验原理 临床上测定的糖化蛋白主要有糖化血红蛋白 glycohemoglubin GHb 和糖化血清蛋白 glycatedserumprotein GSP 测定糖化蛋白的方法有比色法 电泳法 等电聚焦法 离子交换层析法 高效液相层析法 亲和层析法 免疫化学法 毛细管电泳法等 国内以比色法 离子交换层析法及电泳法较常用 二 实验原理 带负电荷的Bio Rex70阳离子交换树脂与带正电荷的HbA及HbAi有亲和力 但由于HbAi的两个 链N 末端正电荷被糖基清除 正电荷较HbA少 二者对树脂的亲和力不同 用pH6 7磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少 吸附力较弱的HbA1洗脱下来 再用分光光度计测定洗脱液中的HbA1占总Hb的百分数 三 器材及试剂 1 器材 1 塑料微柱 2 紫外 可见分光光度计 三 器材及试剂 2 试剂 1 0 2mol L磷酸氢二钠溶液 称取无水磷酸氢二钠28 369g 溶于蒸馏水中并定容至1L 2 0 2mol L磷酸二氢钠溶液 称取NaH2PO4 2H2O31 206g 溶于蒸馏水中并加1L 3 溶血剂 取试剂 2 25ml 加TritonX 100100mg 加蒸馏水至100ml 4 磷酸盐缓冲液 pH6 7 取试剂 1 100ml 试剂 2 150ml 加蒸馏水至1L 5 磷酸盐缓冲液 pH6 4 取试剂 1 300ml 试剂 2 700ml 加蒸馏水300ml 混匀即成 6 Bio Rex70阳离子交换树脂 200 400目 钠型 分析纯级 四 操作步骤 1 树脂处理称取树脂4g 加0 1mol L氢氧化钠溶液15ml 搅匀 置室温30min 间隔搅拌2 3次 然后加浓盐酸数滴 调至pH6 7 弃去上清液 用蒸馏水约25ml洗1次 再用试剂 5 10ml洗2次 最后用试剂 4 洗4次即可 2 装柱树脂加试剂 4 搅匀 用毛细滴管加入塑料微柱内 使树脂床高度达3 4cm即可 树脂床应均匀 无气泡 无断层才可 3 血红蛋白溶液的制备取EDTA抗凝血或毛细管血20 L 加入2 0mL生理盐水中 摇匀 2000rpm离心5分钟 弃上清液 仅留下细胞 加溶血剂0 3ml 摇匀 置37 水浴中15min 以除去不稳定的HbA1 四 操作步骤 4 柱的准备将微柱摇动使树脂混悬 然后去掉上下盖 将柱插入1 5cmx15cm的试管中 让柱内缓冲液完全流出 5 上样用微量加样器取血红蛋白溶液100 l 加至微柱内树脂床上 待其完全进入树脂床后 将柱移入另一支1 5cmx15cm的试管中 6 洗脱取试剂 4 3ml缓缓加至树脂床上 注意勿冲动树脂 收集洗脱液 此即为HbA1 测定 四 操作步骤 7 对照取上述血红蛋白溶液50 L 加蒸馏水7 5ml 摇匀 此即为总Hb管 8 比色以蒸馏水作空白 415nm波长 测定各管吸光度 9 柱的清洗用过的柱先加试剂 5 3ml 使Hb全部洗下 再用试剂 4 洗3次 每次3ml 最后加试剂 4 3ml 加上下盖 保存备用 五 计算 参考值HbAl 6 59 0 69 六 临床意义 糖化血红蛋白测定用于评定糖尿病的控制程度 当糖尿病控制不佳时 糖化血红蛋白浓度可高至正常2倍以上 因为糖化血红蛋白是血红蛋白生成后与糖类经非酶促结合而成的 它的合成过程是缓慢的 而且是相对不可逆的 持续于红细胞120天生命期中 其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比 因此 糖化血红蛋白所占比率能反映测定前1 2个月内平均血糖水平 现已成为反映糖尿病较长时间血糖控制水平的良好指标 七 注意事项 1 层析时一般在28 较为适宜 冬季应将柱置于28 温箱中洗脱 2 HbA1不能和HbF HbH及HbBart s分开 有前述异常血红蛋白病者不宜用此方法 3 标本置