pcr的发展历程ppt课件

PCR的发展历程 PCR技术的基本原理PCR 聚合酶链式反应 1983年由美国科学家KaryMullis提出 1993年因此而获诺贝尔奖 PCR技术是指通过模拟体内DNA复制的方式 在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术 它包括变性 退火 延伸三个步骤 模板DNA的变性 模板DNA经加热至93 左右一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 模板DNA与引物的退火 复性 模板DNA经加热变性成单链后 温度降至55 左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下 以dNTP为反应原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性 退火 延伸三过程 就可获得更多的 半保留复制链 而且这种新链又可成为下次循环的模板 每完成一个循环需2 4分钟 2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 标准的PCR反应体系 10 扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol L引物各10 100pmol模板DNA0 1 2ugTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素 引物 酶 dNTP 模板和Mg2 PCR的发展史1985年美国PE Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 1988年初 Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR 其扩增的DNA片段很均一 真实性也较高 只有所期望的一种DNA片段 但每循环一次 仍需加入新酶 1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 thermusaquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶 此酶的发现使PCR广泛的被应用 第一代 手动 机械手式水浴基因扩增用三个恒温水浴箱 分别将三个水浴温度恒定在三个温度 PCR的高温变性温度 如94 低温复性温度 如58 适温延伸温度 如72 再用一个装有PCR标本试管的提篮 用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴 这种方法的特点是 实验人员劳动强度大 容易因疲劳引起差错 而优点是 设备简单 投资少 与自动化基因扩增仪相比 它无须升降温过程 实验时间短 试验更接近理想PCR反应条件 第二代 自动化控制型PCR 特点 使用广泛及具有代表性 采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析 但存在着操作繁琐 只适用于定性研究 交叉污染风险大等不足 第三代PCR 实时荧光定量PCR 为了避免上述传统PCR的缺陷 并对基因的表达水平进行定量分析 1992年诞生了所谓 第三代PCR 的荧光定量实时PCR 所谓real timeQ PCR技术 是指在PCR反应体系中加入荧光基因 利用荧 光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法 数字PCR由于定量PCR的分析最终结果依赖于Cq值 在这个意义上所谓的 定量 也只是相对的 而且在低拷贝靶分子 模板浓度差异细微的条件下 其检测的灵敏度 精确度都受到了限制 在这种背景下 数字PCR 应运而生 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术 相较于实时荧光定量PCR 数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数 是对起始样品的绝对定量 因此特别适用于依靠Ct值不