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研究生科研实验教学基地建设基本实验技能培训 首都医科大学附属北京朝阳医院基础医学研究中心 梁燕85231624 liangyan1990 主要内容 1 DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项 2 PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项 3 琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项 1 DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项 1 1基因组DNA提取原理 既要将DNA与蛋白质 脂类和糖类等分离 又要保持DNA分子的完整 仪器准备 台式离心机 恒温水浴锅 紫外分光光度计 移液器 离心管 灭菌 吸头 灭菌 镊子 灭菌 离心管架试剂准备 试剂盒 无水乙醇等 1 2基因组DNA提取 试剂盒 试剂盒内容 操作步骤 重点 向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇 并标记 向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇 并标记 取200ul全血 加入20ul的蛋白酶K溶液 混匀 加入200ul缓冲液GB 充分颠倒混匀 56 放置10分钟 期间颠倒混匀数次 溶液应变清亮 加入200ul无水乙醇 充分颠倒混匀 此时可能会出现絮状沉淀 将吸附柱CB3放入收集管中准备好 将上述溶液移到吸附柱CB3中 12000rpm离心30秒 倒掉收集管中的废液 将吸附柱放回收集管 如果步骤5的溶液不能一次加完 可以再次重复步骤6 向吸附柱中加500ul的缓冲液GD 12000rpm离心30秒 倒掉收集管中的废液 将吸附柱放回收集管 操作步骤 重点 7 向吸附柱中加入700ul漂洗液PW 12000rpm离心30秒 倒掉收集管中的废液 将吸附柱放回收集管 向吸附柱中加入500ul漂洗液PW 12000rpm离心30秒 倒掉收集管中的废液 将吸附柱放回收集管 将吸附柱和收集管再次离心 12000rpm离心2分钟 将吸附柱至于室温放置数分钟 将吸附柱转入一个干净的离心管中 向吸附膜中间位置悬空滴加50 200ul洗脱缓冲液TB 室温放置2 5分钟 12000rpm离心2分钟 将溶液收集到离心管中 测OD值 计算DNA浓度和纯度 或电泳估计DNA浓度 计算公式 OD260 OD280 1 7 1 9DNA浓度 ug ul OD260 50 稀释倍数 1000OD260 0 1稀释倍数 250DNA浓度 0 1 50 250 1000 1 25ug ul 操作注意事项 避免样品反复冻融 56 水浴摇匀可消除GB中的沉淀 使用台式离心机 室温离心 2 PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项 仪器准备 PCR仪 微型离心机 移液器 离心管 灭菌 吸头 灭菌 镊子 灭菌 离心管架试剂准备 ddH2O PCRBuffer dNTP 引物 PCR聚合酶 DNA模板 2 1PCR体系和循环条件 重点 95 30s 预变性 72 30s 后延伸 30cycles 2 2PCR操作步骤 重点 计算好所需扩增的PCR体系 打开PCR仪预热 设置PCR循环条件 准备试剂 融化 离心 置于冰上 备用 按顺序加样 混匀 离心 分装 加入模板DNA 混匀 离心 放入PCR仪 Start 2 3PCR操作注意事项 避免试剂反复冻融 计算总量 顺序加样 更换吸头 避免污染 3 琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项 3 1琼脂糖凝胶电泳原理 DNA分子带负电荷 在直流电场中由负极移向正极 其移动速度与线性DNA片段长度成反比 配置1 的胶 称1g琼脂糖于适当大小三角瓶中 倒入100ml的1 TAE 微波炉加热至完全融化 待凝胶温度降至50 60度时 加入1ul的EB 10mg ml 摇匀 将胶倒入放好梳子的电泳板中 自然冷却30 60分钟 轻轻拔掉梳子 将胶放入电泳槽中 倒入1 TAE 没过加样孔 按照1ul上样Buffer 5ul的DNA混合后 点样 每排留一个孔加DNAmarker 100V电泳30分钟 凝胶成像仪照相 3 2琼脂糖凝胶电泳方法 重点 3 3电泳操作注意事项 带手套操作EB 凝胶冷却时间至少30分钟 凝胶完全融化 MII 3II 2II 1I 2I 10 应用BclI RFLP多态位点进行基因连锁分析 374 211 163 小结 1 DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项 2 PCRPCR体