b第四章-基因工程的常规技术上PPT课件

1 第四章基因工程的常规技术 上 一 凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳的影响因素二 杂交技术探针与探针标记Southern杂交Northern杂交Western杂交菌落原位杂交三 PCR技术 2 基因工程常规技术 常规的基因工程技术的研究方法 凝胶电泳技术 核酸分子杂交技术 细胞转化 文库构建 PCR技术 DNA测序技术 酵母双杂交技术等 3 一 凝胶电泳技术 4 琼脂糖是一种线性多糖 从红色海藻琼脂中提取而来的良好的电泳介质 其密度是由琼脂糖的浓度决定的 分辨DNA片段的范围为0 2 50kb之间 聚丙烯酰胺凝胶 过硫酸胺与TEMED N N N N 四甲基乙二胺 是单体丙烯酰胺的催化剂和诱变剂 它们使单体丙烯胺聚合成长链 长链与长链间就交联成凝胶 链长和交联成决定了凝胶的孔径 分辨DNA范围为1个碱基对到1000个碱基对之间 琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳 5 琼脂糖电泳的基本原理 当一种分子被放置在电场当中时 它们就会以一定的速度移向适当的电极 电泳分子的迁移速度同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 6 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 电泳图谱 7 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 电泳分子的迁移速度又同分子的摩擦系数成反比 因此根据分子大小 构型或形状所带的净电荷的不同 便可各种成分分离开来 在生理条件下 核酸分子中的磷酸基团 呈离子化状态 负电荷 当核酸分子在电场中时 会向正电极的方向迁移 在一定的电场强度下 DNA分子的电泳迁移率 取决于核酸分子本身的大小和构型 8 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 9 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 10 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 溴化乙锭 核酸分子染色剂 在凝胶电泳中 加入溴化乙锭对核酸分子染色之后 在紫外光下观察 便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA谱带 溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料 可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间 并在300nm波长的紫外光照射下放射出荧光 可用来显现凝胶中的核酸分子 一是直接在琼脂糖凝胶中加入EB 电泳完后直接检测 也可以在电泳完后进行EB染色检测 11 1 琼脂糖凝胶电泳的原理 溴化乙锭扁平分子染料插入到核酸中 12 2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 1 凝胶的类型和浓度琼脂糖凝胶电泳分辨大小在0 1 60kb间的DNA片段 而要分辨较小分子质量的DNA片段 要用聚丙烯酰胺凝胶 它的分辨率在0 001 1kb之间 凝胶浓度 DNA片段的大小 kb 0 3 琼脂糖 0 7 琼脂糖 1 0 琼脂糖 1 2 琼脂糖 1 5 琼脂糖 2 0 琼脂糖 10 60 1 20 0 5 8 0 4 6 0 2 5 0 1 3 13 2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 2 缓冲液的pH值常用电泳的缓冲液的pH一般在8 0左右 其离子强度为0 02 0 05 实验室常用的缓冲液有硼酸盐缓冲液 TBE 与醋酸缓冲液 TAE TBE的缓冲能力要高于TAE 为防止电泳缓冲液pH和离子强度的改变 可定期更换缓冲液 14 2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 3 电泳的电压和时间适当减低电压 可使分子筛效应相对增强而提高分辨率 一般使用电压为100 150V 电泳时间过长 DNA条带易弥散 但电泳时间过短 很多带又分不开 15 2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 4 琼脂糖凝胶的种类低熔点 LMP 琼脂糖经过了羟乙基修饰 LMP琼脂糖 熔点为62 65 一旦熔解 在37 下持续保持液体状态达数小时 在25 下可持续保持液体状态约10分钟 LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶 即可用来回收DNA分子 一旦LMP琼脂糖已经熔化 并保持在37 下 可直接进行一定的酶催反应 16 聚丙烯酰胺凝胶 polyacrylamidegel 是由单体 monomer 丙烯酰胺 acrylamide 简称Acr 和交联剂 crosslinker N N 甲叉双丙烯酰胺 N N methylenebisacrylamide 简称Bis 在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶 用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophorsis 简称PAGE 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 17 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化 使体系发生氧化还原作用来完成的 催化体系主要有化学催化 AP TEMED 和光化学催化 核黄素 TMTED 体系 1 化学聚合 AP TMTED催化体系 TMTED是一种脂肪族叔胺 它的碱基可催化溶液中的AP使其形成游离氧自由基 激活Acr单体形成单体长链 同时在交联剂Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶 2 光聚合 催化剂是核黄素 核黄素在光照下能够产生自由基 催化聚合反应 一般光照2 3小时即可完成聚合反应 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 18 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法 特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系 符合下式 logMW K bX式中 MW为分子量 X为迁移率 k b均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白质在相同条件下进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 19 20 21 22 二 杂交技术 23 1 探针与探针标记 杂交的目的是为了检测出同源DNA序列 为了达到这一目的 需要使用有标记的探针 探针 带有能检测的标记物的DNA或RNA片段称为探针 探针标记 使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记 24 1 探针与探针标记 1 切口平移标记 nicktranslation 控制DnaseI的浓度 在双链DNA分子一条链的有限位置打开切口 形成3 OH和5 P末端 DNA聚合酶I结合到切口处 它的5 3 外切酶活性将DNA一条链的核苷酸一个个切除 暴露出另外一条单链 以其为模板以5 3 聚合酶的活性将标记的核苷酸加在3 OH末端 25 1 探针与探针标记 2 随机引物标记 RandomPrimer 使用人工合成的能与任何DNA模板多个位点配对的随机引物 双链DNA模板变性后 随机引物与单链模板DNA形成杂合分子后 在DNA聚合酶I的Klenow片段的作用下 以标记的核苷酸为原料合成与模板互补的探针 只需使用一种酶 更为简单 合成的探针长度均一 26 随机引物法标记探针 27 2 Southern杂交 由E Southern于1975年首次设计使用 为鉴别DNA的杂交技术 原理 毛细管作用或在真空状态下使电泳凝胶中分离的DNA片段转移到滤膜上 再与同标记的单链DNA或RNA探针杂交作用 检测杂交信号 28 Southern杂交技术 29 SouthernDNA印迹杂交X显像图片 2 Southern杂交 30 Northern杂交 1979年 J C A1wine等人发展出了一种新的方法 同Southern的DNA印迹杂交技术十分类似 所以叫做Northern杂交技术 Northernblotting 为鉴别RNA的杂交技术 Northern杂交的定义是 将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上 进行核酸杂交的一种实验方法 31 4 Western杂交 为鉴别蛋白质的杂交技术 蛋白质用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后 将蛋白质从凝胶转移到一固相支持物上 如醋酸纤维素膜 PVDF膜 通过抗体与附着于固相的蛋白质所呈现的抗原抗体反应来对蛋白质进行检测 转膜 32 4 Western杂交 Western杂交显像图片 33 5 菌落原位杂交 对菌落中DNA进行原位鉴定 34 三 PCR技术 35 1 PCR技术的发现 聚合酶链式反应 PolymeraseChainReaction PCR 方法始于20世纪70年代早期 有Khorana与其同事提出建议 作为一种降低化学合成基因工作量的策略 其想法被遗忘 在1985年KaryMullis及其Cetus公司的同事们 首次用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段体外扩增出哺乳动物基因片段 他们因此获得1993年诺贝尔生理学和医学奖 36 但在发现耐热的Taq酶之前 PCR还不是成熟的技术 多种耐热聚合酶的发现 使PCR技术走向了每一个分子生物学的实验室 目前PCR技术可扩增长达35 50kb的DNA片段 PCR技术得到了快速的发展 在分子生物学研究中发挥着重要的作用 1 PCR技术的发现 37 2 PCR技术的基本成分 1 模板 2 DNA聚合酶 如 Taq酶 3 引物 一般18 30个核苷酸 4 四种脱氧核苷酸的混合物即 dATP dTTP dCTP dGTP 5 反应的缓冲液 38 1 模板 理论上讲一个DNA分子也能扩出 一般来说 模板在反应体系中最低50pg也能扩出 但是 模板量不可太多 太多容易糊掉 非特异扩增 39 2 DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶 从耐热的水生嗜热菌 Thermusaquaticus 中分离出来 故名 扩增速度高 约1kb min 因无校对功能 错掺比例为1 20000左右 1 300 Pfu聚合酶 扩增效率低 约600bp min 因有校对功能 包真性好 TaqPlus 为TaqDNA聚合酶与Pfu酶按一定比例混合 保真性好 扩增效率高 Adventure黄金酶 保真性好 扩增效率高 但价格昂贵 40 3 引物 G C含量 在40 60 之间 避免4 5个一样的碱基相连 如AAAA 引物长度 在15 25个核苷酸 Tm值在55 以上 扩增长度 以300 500bp合适 也可长到几个kb 其3 碱基要求严格配对 避免为T 引物尽量避免自身配对 避免引物内部出现二级结构 引物的特异性 应与序列数据库中的其他序列具有显著差异 引物上可加上酶切位点 对于接下来的克隆操作有利 引物设计是关键 41 4 四种脱氧核苷酸的混合物 工作浓度一般为20 200 mol L 浓度太高不好 连续几次PCR扩增时要注意补充四种脱氧核苷酸的混合物 42 5 反应的缓冲液 Mg2 的浓度可显著影响PCR的产量 保真性 酶活力等 一般用量为1 5 2mmol L 明胶 BSA Tween20及DTT对酶有一定的保护作用 Tris HCl pH8 3 提供缓冲环境 以上物质均保存于 20 43 3 PCR技术的原理和过程 1 变性温度 保证DNA双链解开 一般为94 30s即可 2 退火温度和时间 PCR的特异性取决于退火过程中引物与模板的结合 一般在50 60 之间 退火温度越高 产物的特异性越高 3 延伸温度和时间 一般为72 延伸 小于1kb的长度1 2min即可 4 循环数 一般在30 36左右 也可多到45个循环 但循环次数太多后 会增加非特异扩增的出现 44 指数增长 变性 退火 延伸 45 3 PCR技术的原理和过程 PCR反应的温度循环周期 46