细胞龛中造血干细胞和祖细胞的活体示踪.docx

活体动物位于其龛中的造血干细胞/祖细胞的追踪Abstract干细胞留驻在一个特化的，受调控的环境中，这个环境称为龛，龛控制着干细胞如何产生，维持及修复组织（1，2）。我们之前记录了移植的造血干细胞和祖细胞群局限在骨髓微血管的亚区域中，那里的化学因子CXCL12特别丰富（3）。将高精度共聚焦显微镜与双光子成像技术联合起来，持续观察活体小鼠颅盖骨骨髓的个体造血细胞，我们在受辐射及c-Kit-受体缺失容受小鼠中（recipient mice），检查了造血干细胞和祖细胞与血管，成骨细胞以及它们定居及移入的骨内膜表面之间的关系。成骨细胞陷入微血管中，而干细胞/祖细胞在这个复杂组织中的相对位置不是随机的，并且是动态的。细胞自主因素和非自主因素都影响了细胞的原始局限化。不同的造血细胞亚群局限在完全不同的位置，这取决于分化的时期。当生理上的激发事件驱动细胞移入或扩张时，骨髓干细胞/祖细胞占据了（assumed）最接近骨和成骨细胞的位置。我们的分析使得我们可以在单细胞水平上实时观察某种过程，之前对这种过程只能在机体水平上研究其长期结果。哺乳动物干细胞龛在很大程度上是基于干细胞的局限化而被定义的，还有少数有限的定义是关于龛内异源细胞的，这种细胞调控干细胞的功能。还没有人在活体上检查过这些龛的生理内容。造血干细胞（HSC）龛已经被研究过，办法是改变骨的组成部分，诱导干细胞功能的变化（47），或是通过免疫组化方式（810）。前者不能精确定义干细胞的局限化，后者则不能定义其功能。一些研究已经记录了成骨细胞在HSC命运上的调控作用（4，7，8，1113）；但是，其它研究显示，从免疫表型上来说最像HSCs的那些细胞被观察到邻近于骨髓中的脉管系统（9）。骨髓脉管系统包括以有规律的间隔穿入密质骨的动脉，分叉成毛细血管覆盖中央窦（central sinus）（14）。长骨的CD31免疫染色可以使人们观察到邻近骨内膜表面的这种脉管网络，特别是骨小梁区域，这是已知的HSCs局限的地方（Fig.1a and data not shown）（7，10）。为了获得关于造血干细胞与祖细胞（HSPC）局限情况的更详细的，动态的视野，我们使用了活体显微观察，按4mm6mm扫描小鼠颅盖骨，包括中央窦以及周围的骨髓腔（Fig.1b）（3）。这一区域HSC的出现频率可以与经免疫表型处理的长骨中的频率相比，并且具有重新填充的能力（Supplementary Fig.2c, d）。由于长骨的厚度阻止了活体显微技术的分析，我们无法确定我们的结果是否能扩展到长骨上，特别是较少骨小梁的骨干区域。将共聚焦显微与双光子显微技术联合起来可以让我们观察深度达到150m，或者75%以上的经我们测量的骨中观察到4060%的骨髓腔。通过第二倍频（SHG）显微技术（见Method），可以同时发现骨，成骨细胞，脉管系统，以及被标记的HSPCs，对成骨细胞限制纤维1启动子（Col2.3-GFP）报导小鼠（15），在注射非靶向性量子原子团（Qdot655 or 800）后立即成像，然后用流式细胞术对染色的细胞进行分类，这些细胞分别是用亲脂性菁Vybrant DiD（1,1-dioctadecil-3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine perchlorate），或DiI（1,1-dilinoleyl-3,3,3, 3-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）（Invitrogen，3）染色的（Fig.1d-h Supplementary Fig.1 and Supplementary Movie 1）。我们联合使用多种细胞表面标志物，以产出高度富集的长期重构HSC群体（LT-HSCs）（16，17）。LKS（即，lineagelow（Linlow），c-Kit（Kit）+以及Scal+）CD34-Flk2-，LKSCD150+CD48-，以及LKSCD48-Flk2-细胞被分离出来，并代表了部分重叠的细胞群（Supplementary Fig.7）。Given that all flow cytometric methods of cell isolation can only enrich for HSCs, we will refer to all the populations used as haematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) to account for any potential progenitor cell contamination. The isolated cells were not adversely affected by DiD staining based on competitive and serial reconstitution assays of irradiated hosts（Supplementary Fig.2a, b）。由于缺乏能够可靠地标记内源性HSPCs的标记物，我们用移植模型来跟踪HSPCs与颅盖骨解剖学微结构之间的相互作用。Z-stack和三维重建显示绿色荧光蛋白呈阳性的成骨细胞是比较大的，不规则，并且相对扁平（厚度10m），沿骨内膜表面不连续分布（Fig.1d-g）。成骨细胞邻近或密切接近脉管系统（60%在脉管系统周围10m内，90%在脉管系统周围20m内）（Fig.1e）。而含有脉管系统的骨髓腔中部没有成骨细胞，骨内膜区域内成骨细胞与脉管密切共局限，提示与成骨细胞有关的HSPCs可能也受到血管/血管旁细胞的旁分泌影响。活体HSPCs三维成像的效率与免疫组化的效率进行比较，方法是注射375000到6106LinlowDiD标记的细胞，然后记录下每个活体成像视野中观察到的细胞数，以及20m固定的脱钙冰冻切片中观察到的细胞数。活体成像总是更敏感一些（Supplementary Fig.3b）。为了确定我们活体观察系统的边界，我们做了稀释实验，并注意到在DiD+成像细胞数量与注射的LKSCD34-Flk2-细胞数量之间有线性关系（Supplementary Fig.3c）。当注射515103LT-HSC富集群时，发现的细胞数量较小（每个受体recipient315细胞），但是连续的，这与颅盖骨骨髓在受体全部骨髓占的较小比例（18），以及HSPC不能自动导向某处的特点（19）是相符合的。注射后最早20分钟即可在骨髓中发现HSPCs，在1.5到3小时长的成像期中始终是稳定的。与之前的研究一致（20），细胞被打散到成像区域（Supplementary Fig.4）。为了评估龛中精确的解剖关系，我们使用Z-stack成像，内含最佳DiD信号焦平面及最近骨内膜表面焦平面（we acquired Z-stack images containing the best focal plane for the DiD signal and the focal plane of the closest endosteal surface）（Supplementary Fig.5）。只有位于骨内膜表面下60m以内的HSPCs才会被进一步分析，因为超过这个距离我们就无法区别位于中央骨髓强的细胞和那些超过了我们观察范围的，邻近更深骨内膜的细胞（见Supplementary Movie 1）。这一方法仅排除了所有成像细胞中的13%，最大程度地发现了深处的细胞，在那样的深度下，SHG，GFP以及Qdot信号过于微弱，不足以取信。我们改造了既定的沉淀检测（lodgement assay）（10，21），以观察未受辐射的受体骨髓中局限化的HSPCs（Fig.2a）。观察到的所有细胞都紧密接近脉管系统（016m），距骨内膜的距离不等，但从未近到30m之内（Fig.2c）。注射后两周，我们发现单个，明亮的DiD阳性细胞局限在骨内膜中1540m处（Supplementary Fig.6a）。如期望的那样，从移植后直到过了4个月，都没有观察到注入的HSPCs对宿主周围血管或骨髓的贡献（数据未列出，也可见引用文献22）。注射到未经辐射宿主体内的HSPCs局限化的位置在骨中30m更深处，并且没有移植成活。移植HSPCs无法在生理条件下的龛中成活这一点，给现有的研究带来了固有的限制，这些研究旨在描述活体中位于其生理状态的龛中的功能性HSPCs。为了观察到能移植成活的HSPCs，进行了致死剂量辐射的野生型和Col2.3-受体小鼠接受了HSPC移植，并在注射后20min到5h进行成像。辐射损害了脉管系统：量子荧光团信号不再能清晰地勾出骨髓血管的边界线了，而是溢出到整个骨髓腔（Fig.2b, red），显示了进行中的损害（Fig.3a,b）。值得注意的是，循环细胞在量子原子团信号中，遵从一条狭窄且分明的轨迹（数据未列出），提示在辐射后，骨髓脉管系统对小颗粒变得通透，比如说量子原子团，但对血细胞不通透。注射到经辐射受体小鼠中的HSPCs也会局限在骨内膜的各种距离深度上，但是在这些条件下，47%的细胞会在骨内膜表面15m内（Fig.2c）。我们监测小鼠长达6个月，观察到在所有的受体小鼠中至少有25%的外周血管多谱系移植成活，因此证明了注射细胞功能上的能力。WWv小鼠携带两种干细胞因子受体c-Kit突变，使得其内源性HSCs与其龛衔接的能力受损（23）。如预料的那样，注射到未经辐射的WWv小鼠中的HSPC移植成活，并超过了内源性HSC对所有外周血谱系细胞的产量（23）（Supplementary Fig.6d）。而WWv小鼠表现出髓外造血，继发性骨髓移植证实了注射进去的野生型HSPCs定居在功能性的，有支持作用的骨髓龛中（Supplementary Fig.6e）。即使是在WWv小鼠的没有被射线损害的脉管系统中，与未受辐射的野生型小鼠相比，野生型HSPCs沉淀的位置离骨表面也要更近一些（Fig.2c）。因此，多种能够让供体细胞在骨髓中移植成活的背景环境，与HSPCs在骨髓中紧密靠近骨内膜这一点是相关的。植入的HSCs在移植后24小时内增殖（24），它们产生的后代在4日内经历多能期和祖细胞早期（25），但之前报道过干细胞群在植入特征上有很大的异质性（26）。利用我们的系统，可以在活体中随时间追踪细胞个体及其直系后代的xyz位置（Fig.3a,b），显示出低染色密度下细胞逐渐蔟集成团，这与细胞分裂上DiD标记出的分隔相一致（Fig.3b）。为了测试细胞蔟集团是否由迁移细胞堆积而成，我们将用DiD染色，或用第二种亲脂性染料，DiI染色的LT-HSC富集群混合在一起，注射到受体小鼠，23天后成像。每个蔟集团的细胞内只有一种染料被观察到（Fig.3d,e），这与移植成活早期单一种类细胞增殖的情况相符合。此外，我们同时应用免疫荧光和荧光活化细胞分类（FACS）分析，观察到5-溴脱氧尿苷（BrdU）被注射的细胞所摄取（Supplementary Fig.9）。我们的分析显示了活体中单细胞水平上细胞分裂类型的异质性。我们试图确定骨髓微环境中的位置是否会受造血细胞内在特征，比如说分化状态的影响。我们在移植后数小时内，对LT-HSC富集群（LKS CD34-Flk2+），多能祖细胞富集群（MPP；LKS CD34+Flk2+）（27，28），定型祖细胞富集群（LinlowKit+Sca-），以及异质性Linlow细胞进行了成像（Fig.4a, b）。LT-HSC富集细胞局限于紧靠内膜和成骨细胞的地方，更成熟的亚群居住的地方则逐渐更远。为了确定细胞的位置是否与细胞的分裂有关，我们将能增殖产生蔟集团（细胞数量3）的细胞的位置，与不分裂细胞的位置做了个比较。静止期细胞明显更接近成骨细胞（Fig.4d）。为了确定龛的变异是否会影响到HSPC的局限化，我们把细胞注射到野生型或PPR小鼠中（即进行了转基因的小鼠，具有结构性活化的甲状旁腺/甲状旁腺相关肽受体，受成骨细胞特异性启动子Col2.3kb驱动）（29）。PPR小鼠的成骨细胞数量增加，骨小梁体积增加，HSCs数量增加（4），并且人们发现，当这种小鼠成为骨髓移植受体时，可以驱动注入的HSCs扩张（30）。注射后2天，PPR小鼠中的DiD+细胞显著靠近骨内膜，即使用减少后的骨髓腔大小进行修正，仍然是显著的（Fig.4e，数据未列出）。因此，龛的干细胞非自主性特点参与调控HSPC的局限化。本文展示的数据揭示了以前提出的，将成骨细胞和血管旁龛截然分开的二分法在颅盖骨的解剖学上行不通的：成骨细胞就是血管旁的。我们无法在长骨骨干或非骨性组织中仅仅排除血管旁的龛，而不排除其它的龛，像在脾中做的那样；但是，骨小梁的微体系提示骨内膜旁龛和血管旁龛是联合的。移植进来的原始造血细胞与骨小梁龛解剖成分的关系，受到细胞固有变异，以及龛固有变异的影响。免疫表型不同的细胞局限化的地方也不同，细胞的干细胞功能越丰富，细胞离骨就越近。另外，微环境中能让干细胞移植成活的那些条件，或是让成骨细胞驱动HSC扩张的那些条件，使HSPCs与骨产生更为密切的联系。骨髓中的解剖学情况是动态的，其中细胞的位置反映了对干细胞的不同生理需求。但是，我们不能总结说HSPC的移植成活或者扩张需要成骨细胞直接的接触，因为这一点尚未被一致观察到。不如