柠檬酸发酵机制ppt课件

柠檬酸发酵机制 重点 柠檬酸生物合成途径 柠檬酸生物合成的代谢调节机制 难点 柠檬酸生物合成的代谢调节机制 一 柠檬酸简介 柠檬酸又名枸橼酸 学名 羟基丙烷三羧酸 是生物体主要代谢产物之一 化学名称2 羟基丙三羧酸 英文文献俗名citricacid 分子式C6H8O7 无色或白色晶体 无臭 味极酸 易溶于水和乙醇 微溶于乙醚 水溶液呈酸性反应 第一节概述 食品工业 酸味剂 增溶剂 抗氧化剂 除腥脱臭剂 医药工业 化学工业 美容品 化妆品 二 柠檬酸及其盐的应用概况 三 我国柠檬酸生产现状 生产状况 60年代开始 生产柠檬酸年总产量居世界第一 出口量一直占国内总产量的50 以上 目前 生产厂家近百家 万吨级以上的有6家 主要有安徽丰原生物化学集团公司 生产能力为12 0万吨 年 江苏无锡罗氏中亚柠檬酸有限公司 生产能力为4 0万吨 年 安徽华源生物药业有限公司 生产能力为3 5万吨 年 等 存在问题 出口量增长过快 技术创新相对滞后 加上国际市场竞争激烈 已出现严重的供大于求的局面 设备利用率不到60 行业经济效益呈滑坡态势 第二节柠檬酸合成途径与代谢调控 1940年 Krebs TCA 1953年 Jagnnathan证实黑曲霉中存在EMP途径所有酶 1954年 Shu提出葡萄糖80 经EMP途径代谢 1954 1955年 Ramakrishman等发现黑曲霉中存在TCA循环 一 柠檬酸合成途径的发现 二 黑曲霉柠檬酸生物合成途径 黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸其生物合成途径是 葡萄糖经EMP HMP途径降解生成丙酮酸 丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA 另一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸 草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸 1 生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径 前者EMP HMP 2 1 后者EMP HMP 4 1 2 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环 在以糖质原料发酵时 当柠檬酸积累时 TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱 3 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱 草酰乙酸是由丙酮酸 PYR 或磷酸烯醇式丙酮酸 PEP 羧化生成的 即由两个CO2固定化反应体系 其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主 三 柠檬酸生物合成的代谢调节机制 1 磷酸果糖激酶 PFK 一 糖酵解及丙酮酸代谢的调节 Mn2 浓度对磷酸果糖激酶的影响 Mn2 缺乏为何会使NH4 浓度升高呢 当培养基中Mn2 缺乏时 微生物体内积累几种氨基酸 GA GLu Arg Oin等 这些氨基酸的积累 意味着体内蛋白质的合成受阻 而外源蛋白质的分解速度则不受到影响 这样NH4 的消耗下降 NH4 浓度就会升高 2 丙酮酸羧化酶 催化生成草酰乙酸 3 丙酮酸脱氢酶 催化生成乙酰CoA 二 三羧酸循环的调节 1 柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是TCA循环第一个酶 但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用 2 顺乌头酸水合酶 异柠檬酸脱氢酶的调节 顺乌头酸水合酶 NAD和NADP 异柠檬酸脱氢酶在柠檬酸产生与不产生时 这3种酶均存在 而当铜离子0 3mg L 铁离子2mg L和pH2 0情况下 这3种酶均不出现活力 发酵中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的 顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸顺乌头酸异柠檬酸正逆反应的酶 研究表明 黑曲霉中有一种单纯的位于线粒体上的顺乌头酸水合酶 它在催化时能建立下面的平衡 柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸 90 3 7 3 酮戊二酸脱氢酶的调节 在黑曲霉柠檬酸产生菌中 TCA循环的一个显著特点是 酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏 因此当以葡萄糖为碳源时 在柠檬酸生成期 菌体内不存在 酮戊二酸脱氢酶或活力很低 酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不可逆反应 一旦 酮戊二酸脱氢酶丧失 就会引起 TCA循环中的苹果酸 富马酸 琥珀酸是由草酰乙酸逆TCA循环生成 使TCA循环成 马蹄形 酮戊二酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性 三 氧对柠檬酸积累的调节 乙酰CoA和草酰乙酸结合生成柠檬酸过程中要引进一个氧原子 因此氧也可以看作为柠檬酸生物合成底物 它对柠檬酸发酵的作用为 1 氧是发酵过程生成的NADH2重新氧化的氢受体 2 近来的研究发现 黑曲霉中除了具有一条标准呼吸链以外 还有一条侧系呼吸链 当缺氧时 只要很短时间中断供氧 就会导致此侧系呼吸链的不可逆失活 而导致柠檬酸产酸急剧下降 四 乙醛酸循环与醋酸发酵柠檬酸 乙醇 乙酸 3醋酸 1柠檬酸生成的柠檬酸一半转化为异柠檬酸酵母N源耗尽后开始烷烃发酵 低浓度AMP抑制NAD 异柠檬酸脱氢酶的活性 柠檬酸大量合成并积累 此时顺乌头酸水合酶催化反应平衡为 柠檬酸 异柠檬酸 顺乌头酸 90 7 3 细胞质中积累大量异柠檬酸 Mn2 缺乏 抑制蛋白合成 NH4 有一条呼吸活动强的不产生ATP的侧呼吸链 解除磷酸果糖激酶的代谢调节 促进EMP途径畅通 丙酮酸羧化酶是组成型酶 不被调节控制 丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡 以及柠檬酸合成酶不被调节 增强了合成柠檬酸的能力 小结 顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡 柠檬酸 顺乌头酸 异柠檬酸 90 3 7同时控制Fe2 含量时 顺乌头酸酶活力降低 使柠檬酸积累 随着柠檬酸积累 pH降低到一定程度时 使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活 更有利于柠檬酸的积累 五 柠檬酸发酵的产率 1 无CO2固定反应的产率 合成1分子柠檬酸需要3分子乙酰辅酶A 也就是需要1 5分子的葡萄糖 理论产率为 192 180 1 5 71 1 2 通过CO2固定反应提供C4二羧酸 四 柠檬酸发酵过程的控制要点 1 控制Mn2 NH4 浓度 解除柠檬酸对PFK的抑制 使EMP畅通无阻 3 控制培养基中的Fe2 的浓度 使顺乌头酸水合酶失活 2 控制溶氧 防止侧系呼吸链失活 五 柠檬酸产生菌育种的传统方法 1 透明圈大的菌株平板 10 甘薯 2 的琼脂 0 5 CaCO3诱变后 涂布 透明圈大的则好2 显色圈大小平板 麦汁培养基 pH值指示剂诱变后 33 培养3天 透明圈大的则好 3 不分解柠檬酸的菌株不利用柠檬酸为碳源的菌株 说明其TCA循环中柠檬酸后续酶的活性较低 或者丧失 这有利于积累柠檬酸 方法 以柠檬酸为唯一碳源的培养基上生长不好的突变株 4 选育不长孢子 少长孢子 迟长孢子的菌株在培养基