1无菌试验操作规程-2015版中国药典

文件名称文件编码无菌试验操作规范制定人日 期部门审核日 期批准人日 期生效日期颁发部门使用区域分发部门：1. 目的： 制定无菌检验标准操作规程，确保检验操作正确。2. 范围： 本标准适用于本公司成品无菌检验操作。3. 职责： 生产部负责提供待检验产品，质量部负责检验，出具检验报告。4. 内容：4.1. 标准依据：中国药典2015年版通则（1101）无菌检查法。4.2. 简述：无菌检查方法系用于检查无菌医疗器械是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。4.3. 环境要求：该项检查应在无菌条件下进行。其全过程必须严格遵守无菌操作。防止微生物污染，但所采取的措施不得影响供试品中微生物的检出。操作前环境洁净度应经验证。日常检验需对试验环境进行监控。4.4. 方法验证：进行该项检查前应进行方法适用性试验。4.5. 人员要求：无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术培训。4.6. 检验数量及检验量：4.6.1. 接种每种培养基所需的最少检验数量 (表1)供试品批产量N(个）接种每种培养基的最少检验数量医疗器具 10010050010%或4件（取较多者）10件2%或20件（取较少者）4.6.2. 检验量（表3）供试品供试品装量每支供试品接入每种培养基的最少量医疗器具 外科用敷料棉花及纱布缝合线、一次性医用材料带导管的一次性医疗器具其他医疗器具取100mg或1cm3cm整个材料二分之一内表面整个器具（切碎或拆散开）4.7. 仪器用具：垂直层流超净工作台、生化培养箱、电热恒温水浴箱、显微镜、手提灭菌器、离心机、双碟、试管、三角瓶、刻度离心管、注射器（针头）、剪刀、镊子、注射器盒、75酒精棉球、紫外光灯365nm、真空泵、一次性使用集菌培养器。4.8. 消毒剂配制： 75乙醇溶液（配制酒精棉球用）。 0.2新洁尔灭溶液（配制消毒棉球用）。 2来苏尔溶液（配制消毒棉球用）。4.9. 试剂及培养基的配制：4.9.1. 0.1蛋白胨水溶液：取蛋白胨1.0g，加水1000ml,微温使溶解，滤清，调节PH值至7.10.2，分装，灭菌。4.9.2. pH7.0灭菌氯化钠蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml微温溶解，滤清，分装，灭菌。4.9.3. 根据供试品特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液、冲洗液。如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂。4.9.4. 硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。分装的容器应适当，其装量与容器高度比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却只限加热一次，并应防止被污染。除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养温度为3035。4.9.5. 胰酪大豆胨液体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保存备用。胰酪大豆胨液体培养基培养温度为2025。4.9.6. 选择性培养基：按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂、灭活剂或表面活性剂。4.9.7. 制备好的培养基应保存在225，避光的环境中。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用。若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。4.10. 试验前的准备工作4.10.1. 用具的洗刷a. 玻璃器皿：如试管、量筒、移液管、刻度吸管、离心管、三角瓶、双碟等用清洁液浸泡，用流水洗涤，再用蒸馏水洗涤45次，倒置，晾干。试管、移液管、三角瓶等使用过后，应先消毒倒出内容物后，再清洗晾干。b. 注射器用水冲洗后，用洗涤剂冲洗，然后用水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3次。c. 剪刀、镊子用水及去污粉洗涤，用水冲洗干净，再用蒸馏水洗涤3次。d. 多用薄膜过滤器，玻璃管等用饮用水及蒸馏水洗净、晾干。e. 洁净服、裤、帽子、口罩等用水洗涤洁净后，晾干。4.10.2. 用具的包扎及灭菌a. 移液管、刻度吸管在管口上端内，松松塞入少许脱脂药物，然后每支管用白纸严密卷好，再用两层牛皮纸一起包扎。b. 洗涤洁净的注射器及适配针头各部件与剪刀、镊子一并入垫有纱布的铝盒内，一层层放好，盖上纱布，将铝盒盖好，用牛皮纸包扎。c. 试管、三角瓶等在管（瓶）口塞上纱布棉纱用牛皮纸包装严密。d. 将洁净服、等用布口袋配套装入，扎紧口袋，用牛皮纸包扎好。e. 将以上包扎好的用具在121蒸汽灭菌20分钟。或采取适宜的灭菌方法。（适宜高温灭菌的器皿可采用160干热灭菌）f. 物品灭菌完毕，勿立即置冷处，以免急速冷却导致染菌，应置恒温培养箱中干燥。4.10.3. 洁净室的清洁与灭菌在每次操作前，应作好清洁工作，并用0.2%新洁尔灭溶液或2%来苏尔或75乙醇擦洗超净台工作台面及可能污染的死角，然后开启紫外线灯杀菌半小时，超净台空气过滤器自净半小时。操作完毕后，用上述消毒液，再次处理工作台面，开紫外光灯杀菌30分钟以上。4.11. 操作 4.11.1. 开启传递窗外侧门，将物品表面消毒后置传递窗内，关闭窗门。4.11.2. 操作人员按进入洁净室更衣程序洗手、更衣换工作鞋，换无菌衣、裤、口罩。进入洁净室内，开启内侧门，取出物品，关闭内侧门，经缓冲间带入洁净室内，物品放置于实验台上，关闭洁净室门，人员离开洁净室，继续用紫外灯照射半小时，关灯，再将用具放入超净台内。4.11.3. 配制的培养基应在凉暗处保存，一般不得超过2周。临用前细菌和霉菌培养基分别经3035和2025培养不少于48小时和72小时，证明无菌生长时方可使用。4.11.4. 阳性对照试验：a. 应根据供试品特性选择阳性对照菌，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照品；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照品。b. 阳性对照试验的菌液制备同方法验证试验。c. 取各阳性对照菌悬液（含菌量小于100CFU）及供试品（用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量），以无菌操作加入相应培养基中，培养4872小时，检查应生长良好。（阳性对照试验操作应与微生物限度检查操作隔离进行，防止交叉污染）。4.11.5. 阴性对照试验：取供试品的相应溶剂或稀释剂冲洗液同法操作，培养14日应无菌生长4.11.6. 供试品检查：供试品外部消毒：包装外壁用75乙醇擦拭，待干。供试品准备：方法一，打开包装，直接剪取合适规格的内部产品，随用随剪，取部分器械（100mg或1cm3cm）培养；方法二，用100ml生理盐水冲洗内包装的产品表面，将滤液过滤，取滤膜培养。在近火焰旁以左手持培养基，右手半握拳，以小指和无名指拔开培养基管棉塞，管口通过火焰，移至火焰下侧，将准备好的供试品加入一培养基管内。每次试验取一半供试品经上述处理分别接入硫乙醇酸盐流体培养基管中，另一半分别接入胰酪大豆胨液体培养基管中。硫乙醇酸盐流体培养基在3035培养14天，胰酪大豆胨液体培养基在2025培养14天。培养期间应逐日检查是否有菌生长，并填写无菌检查记录。如供试品管出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观判断时，可取该培养液接种在另一支相同新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。另取硫乙醇酸盐流体培养基管一支，同法操作，操作结束后，接种对照菌液1ml（小于100CFU）作为供试品阳性对照。硫乙醇酸盐流体培养基，每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基不少于10ml。注入供试液时，切勿向液面直射，以免将空气中的氧带入培养基中，并在火焰旁将塞子塞严。接种后轻轻振动使均匀。4.12. 结果判断：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定;若供试品管中任何显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：（1）无菌检查试验所用设备及环境的微生物监控结果不符合