分子生物学-转录ppt课件

第十六章 RNA的生物合成RNABiosynthesis 掌握 DNA复制和转录的区别掌握 转录模板的特点和所需的酶理解 原核和真核生物转录的过程及二者间的差异熟悉 真核生物mRNA的加工过程 掌握断裂基因 内含子 外显子的概念 了解 tRNA和rRNA的加工 学习目标 在生物界 RNA合成有两种方式 一是DNA指导的RNA合成 也叫转录 此为生物体内的主要合成方式 也是本章介绍的主要内容 另一种是RNA指导的RNA合成 RNA dependentRNAsynthesis 也叫RNA复制 RNAreplication 由RNA依赖的RNA聚合酶 RNA dependentRNApolymerase 催化 常见于病毒 是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式 转录 transcription 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 原料 原则 酶 方向 转录 复制和转录的相同点 酶促的核苷酸聚合 DNA为模板 依赖DNA的聚合酶 生成3 5 磷酸二酯键 5 3 方向聚合 遵从碱基配对规律 复制和转录的区别 引物需要不需要 参与转录的物质 原料 NTP ATP UTP GTP CTP 模板 DNA酶 RNA聚合酶 RNApolymerase RNA pol 其他蛋白质因子 模板和酶TemplatesandEnzymes 第一节 5 3 3 5 模板链 编码链 编码链 模板链 一 转录模板 不对称转录 不对称转录 asymmetrictranscription 在DNA分子双链上某一区段 一股链用作模板指引转录 另一股链不转录 模板链并非永远在同一条单链上 DNA分子上能转录出RNA的区段 称为结构基因 structuralgene DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链 称为模板链 templatestrand 也称作无意义链或Watson链 相对的另一股单链是编码链 codingstrand 也称为有意义链或Crick链 5 GCAGTACATGTC 3 3 cgtgatgtacag 5 5 GCAGUACAUGUC 3 N Ala Val His Val C 编码链 模板链 mRNA 蛋白质 转录 翻译 RogerKornbergWonNobelPrizeforchemistry2006 二 RNA聚合酶 一 RNA聚合酶催化RNA链合成的机制 RNA合成的化学机制与DNA依赖的DNA聚合酶催化DNA合成相似 NMP n NTP NMP n 1 PPi RNA 延长的RNA DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在 而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长 二 原核生物的RNA聚合酶 1种 核心酶 coreenzyme 全酶 holoenzyme 参与转录延伸 参与转录起始 利福平和 亚基结合抑制RNA聚合酶 三 真核生物的RNA聚合酶 3种 均由多个亚基构成 抑制剂 鹅膏蕈碱 毒蘑菇 死亡之伞 Amanitaphalloides deathcap amanitin 真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂 所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基 RNA聚合酶 由12个亚基组成 其最大的亚基称为RBP1 RNA聚合酶 最大亚基的羧基末端有一段共有序列 consensussequence 为Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser的重复序列片段 称为羧基末端结构域 carboxyl terminaldomain CTD CTD对于维持细胞的活性是必需的 原核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninProkaryote 第二节 一 转录起始 一 原核生物的转录过程 起始延长终止 2 DNA双链局部解开 形成开放转录复合体 opentranscriptioncomplex 1 RNA聚合酶全酶 2 与模板结合 形成闭合转录复合体 closedtranscriptioncomplex 3 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应 形成转录起始复合物 RNApol 2 DNA pppGpN OH3 转录起始复合物 5 pppG OH NTP 5 pppGpN OH3 ppi 转录起始过程 4 亚基脱落 1 模板上酶的辨认 结合 调节序列 转录是不连续 分区段进行的 每一转录区段可视为一个转录单位 称为操纵子 operon 操纵子包括若干个结构基因及其上游 upstream 的调控序列 调控序列中的启动子是RNA聚合酶最先结合模板DNA的部位 也是控制转录的关键部位 原核生物以RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上而起动转录 其中由 亚基辨认启动子 其他亚基相互配合 对启动子的研究 常采用一种巧妙的方法即RNA聚合酶保护法 RNA聚合酶保护法 Footprinting 开始转录 TTGACAAACTGT 35区 Pribnowbox TATAATATATTA 10区 原核生物启动子保守序列 RNA pol辨认位点 recognitionsite RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合 E coli开放转录复合体的形成 2 DNA双链局部解开 形成开放转录复合体 opentranscriptioncomplex 1 RNA聚合酶全酶 2 与模板结合 形成闭合转录复合体 closedtranscriptioncomplex 3 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应 形成转录起始复合物 RNApol 2 DNA pppGpN OH3 转录起始复合物 5 pppG OH NTP 5 pppGpN OH3 ppi 转录起始过程 4 亚基脱落 cycle 二 转录延长 1 亚基脱落 RNA pol聚合酶核心酶变构 与模板结合松弛 沿着DNA模板前移 2 在核心酶作用下 NTP不断聚合 RNA链不断延长 NMP n NTP NMP n 1 PPi UnwindinggeneratessupercoilsintheDNAthatcanberelievedbyDNAtopoisomerases ActinomycinDwasthefirstantibiotictofindtherapeuticapplicationintumorchemotherapy ItbindstotheDNAtemplateandinterfereswiththemovementofRNApolymerasealongtheDNA 转录空泡 transcriptionbubble RNA pol 核心酶 DNA RNA 5 3 DNA 原核生物转录过程中的羽毛状现象 核糖体 RNA RNA聚合酶 在同一DNA模板上 有多个转录同时在进行 转录尚未完成 翻译已在进行 这种形状说明 原核生物的边转录边翻译电镜照片 识别转录起始部位 与模板链结合 并使DNA双链打开 催化NTP的聚合 缺乏外切酶活性 无校对功能 不同的 识别不同的转录起始位点 RNA聚合酶作用特点 依赖Rho 因子的转录终止非依赖Rho因子的转录终止 三 转录终止 指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进 转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来 分类 1 非依赖Rho因子的转录终止 DNA模板上靠近终止处 有些特殊的碱基序列 转录出RNA后 RNA产物形成特殊的结构来终止转录 这种方式较普遍 反向重复序列与发夹Invertedrepeatsandhairpins 5 NNGAATGCCNNNGGCATTCNN3 3 NNCTTACGGNNNCCGTAAGNN5 5 NNGAAUGCCNNNGGCAUUCNN3 茎环 发夹结构 茎环结构使转录终止的机理 使RNA聚合酶变构 转录停顿 使转录复合物趋于解离 RNA产物释放 ATP 2 依赖Rho因子的转录终止 相对少见 主要见于噬菌体 Rhofactor ATPaseactivityhelicaseactivity易与polyC结合 真核生物的转录过程TheProcessofTranscriptioninEukaryote 第三节 一 转录起始前的上游区段 不同物种 不同细胞或不同的基因 转录起始点上游可以有不同的DNA序列 但这些序列都可统称为顺式作用元件 cis actingelement 一 真核生物的转录起始过程 真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化 转录起始时 RNA pol不直接结合模板 其起始过程比原核生物复杂 顺式作用元件包括启动子 启动子上游元件 upstreampromoterelements 或promoter proximalelements 等近端调控元件和增强子 enhancer 沉默子等远隔序列 一个典型的真核生物基因上游序列 起始点上游多数有共同的TATA序列 称为Hognest盒或TATA盒 TATAbox TATA盒和Inr一起通常被称为核心启动子 TATA盒的作用在于决定转录的起点 序列的改变会使转录位点偏移 缺失TATA盒 转录将在许多位点上开始 TATA盒决定转录的效率 如鸡蛋清蛋白基因启动子的TATA变为TAGA后 转录效率大大下降 转录起始点 TATA盒 CAAT盒 GC盒 增强子 顺式作用元件 cis actingelement AATAAA 切离加尾 转录终止点 修饰点 外显子 翻译起始点 内含子 OCT 1 OCT 1 ATTTGCAT八聚体 二 转录因子 能直接 间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质 现已发现数百种 统称为反式作用因子 trans actingfactors 反式作用因子中 直接或间接结合RNA聚合酶的 则称为转录因子 transcriptionalfactors TF 或基本转录因子 通用转录因子 参与RNA pol 转录的TF 稳定TF D DNA复合物 结合RNApol促进RNApol结合及作为其它因子结合的桥梁解螺旋酶 结合TF H解旋酶 作为蛋白激酶催化CTD磷酸化 三 转录起始前复合物 pre initiationcomplex PIC 真核生物RNA pol不与DNA分子直接结合 而需依靠众多的转录因子 TF F A B 由RNA Pol 催化转录的PIC pre initiationcomplex H E TBP TAF TF D A B DNA复合物 TATA A B TBP TAF TATA H E PIC组装完成 TF H解开双螺旋并使CTD磷酸化 型基因中的四类转录因子 RNA聚合酶II与启动子的结合 启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用 通常包括多种顺式作用元件与反式作用因子的作用 因子和因子之间互相辨认 结合 以准确地控制基因是否转录 何时转录以及转录的效率 PIC的形成 四 拼板理论 piecingtheory 为了保证转录的准确性 不同基因需不同转录因子 拼板理论 piecingtheory 少数几个反式作用因子 主要是可诱导因子和上游因子 之间互相作用 再与基本转录因子 RNA聚合酶搭配而有针对性地结合 转录相应的基因 二 转录延长 真核生物转录延长过程与原核生物大致相似 但因有核膜相隔 没有转录与翻译同步的现象 RNA pol前移处处都遇上核小体 转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象 RNA Pol RNA Pol RNA Pol 核小体 转录延长中的核小体移位 转录方向 5 AAUAAA 5 AAUAAA 核酸酶 GUGUGUG RNA pol AATAAAGTGTGTG 转录终止的修饰点 5 5 3 3 3 加尾 AAAAAAA 3 mRNA 三 转录终止 和转录后修饰密切相关 复制与转录特点比较 真核生物的转录后修饰Post transcriptionalModification 第三节 真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物 primaryRNAtranscript 几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工 才能成为具有功能的成熟的RNA 加工主要在细胞核中进行 几种主要的修饰方式 1 剪接 splicing 2 剪切 cleavage 3 化学修饰 modification 4 添加 addition 5 编辑 一 真核生物hnRNA的加工包括首 尾修饰和剪接 一 hnRNA在5 末端加 帽 大多数真核mRNA的5 末端有7 甲基鸟嘌呤的帽结构 这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶 加帽酶 cappingenzyme 和甲基转移酶 methyltransferase 催化完成 帽子结构 5 m7GpppGp 5 pppGp 5 GpppGp 帽子结构的生成 m7Gpppm7GpppN1mp m7GpppN1mpN2mp 帽子结构功能 1 保护mRNA免受核酸酶水解 2 与帽结合蛋白质复合体结合 并参与mRNA和核糖体的结合 与翻译起始有关 3 与mRNA向核外的转运有关 4 增强mRNA剪接效率 尾结构 polyA加尾过程 先由核酸外切酶切去3 末端一些过剩的核苷酸 然后加入polyA 二 前体mRNA在3 端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾 多聚腺苷酸聚合酶 poly A polymerase PAP 利用polyA纯化mRNA 尾功能 1 保护RNA 防止被水解 2 与翻译起始有关 3 与mRNA向核外的转运有关注意 并不是所有基因的转录产物都有polyA尾 断裂基因 外显子和内含子 why what hnRNA HOW 二次转酯反应 三 hnRNA的剪接 TOOL snRNA 剪接体 1993年诺贝尔生理学或医学奖得主 罗伯茨RichardJ Roberts美国贝弗莉新英格兰生物实验室1943年 夏普PhillipA Sharp美国麻省理工学院癌症研究中心1944年 why 鸡卵清蛋白成熟mRNA与DNA杂交电镜图 DNA mRNA 目录 why 真核生物中的结构基因由若干个编码区和非编码区相互间隔 但又连续镶嵌而构成 因此真核生物的结构基因称为断裂基因 断裂基因 splitgene 编码区A B C D why 外显子在断裂基因及其初级转录产物上出现 并表达为成熟RNA的核酸序列 内含子隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列 注意 并不是所有外显子均表达 所有内含子均不表达 why 内含子的分类 根据基因的类型和剪接的方式 通常把内含子分为4类 I 主要存在于线粒体 叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因 II 也发现于线粒体 叶绿体 转录产物是mRNA III 是常见的形成套索结构后剪接 大多数mRNA基因有此类内含子 IV 是tRNA基因及其初级转录产物中的内含子 剪接过程需酶及ATP 剪接体 spliceosome WHO 2015年8月 酵母剪接体的高分辨率结构2016年12月又陆续报道了酵母剪接体在不同工作状态下的高分辨结构2017年5月12日 人源剪接体的原子分辨率结构 tool snRNA smallnuclearRNA 种类 U1 U2 U4 U5 U6 GUAAGU AG UACUACA 共有序列 支点序列 5 3 exons 外显子 introns 内含子 hnRNA HOW 内含子的结构 IVS 2 654 C T 剪接突变是 地中海贫血的一种最常见的基因突变 据统计 1 3以上的遗传性疾病与RNA剪接异常有关 U1snRNP与U2snRNP的识别结合 HOW SnRNP s对内含子的识别结合 branchsitesequence U1snRNA U2snRNA A 5 splicesite U1snRNP U2snRNP 3 splicesite 剪接体 U1 U2 U5 U4 U6 U4 5 3 5 5 5 3 3 3 U5 U4 U6 lariatform 套索状结构 剪接过程 HOW 第一次转酯反应 第二次转酯反应 剪接的机制 二次转酯反应 HOW 鸡卵清蛋白基因 hnRNA 首 尾修饰 hnRNA剪接 成熟的mRNA 鸡卵清蛋白基因及其转录 转录后修饰 选择性剪切选择性剪接 前体mRNA分子可发生可变剪接和可变剪切 剪接小结 对象 hnRNA 原因 工具 断裂基因 外显子 内含子 剪接体 snRNPs snRNA 过程 套索状结构 机制 二次转酯反应 三 mRNA的编辑 mRNAediting 概念 对mRNA外显子的加工过程 mRNA