分子光谱分析Chapter05ppt课件

Ch5 INSTRUMENTs 山西大学SHANXIUNIVERSITY Ch02仪器 1 光源入射和出射狭缝2 光栅 1滤光片或起偏器参比PMT3 样品系统滤光片或检偏器入射和出射狭缝2 光栅 24 检测器 2 1基本组件 1 lightsource 2 excitingfilter 3 fiberopticalbundle 4 barrierfilter 5 photodetector Apparatusconsistsofahalogenlamp 75W 2fiberopticalbundlesfortransferbothexcitinglighttoanobjectandfluorescencelighttophotodetector photometricdevice imageanalyser 2 1 1光源传统的稳态光源 表2 1汞灯的线光谱 nm 氙灯的光强度较汞灯相对较低 但是可以提供连续光谱 而且在较宽波段内光强度的变化较小 只是在紫外区200 300nm范围的光强度较低 是目前最常用的光源 氙灯长时间工作时 光输出强度会浮动 需要进行校正 氙灯的特征线可用于校正单色器 氙汞灯作为光源 即可提供较强的光强度 又可以提供连续光谱 然而在汞线波长下的光强度更强 氘灯虽然也用作紫外光源 但是发射强度低得多 因此常用在紫外可见分光光度计上作为光源 Time 脉冲光源和稳态光源输出特性比较 脉冲光源 FlashingSources 进行时间分辨分析或磷光测定时 需要脉冲光源 闪光灯和激光都可以作为脉冲光源 其中激光是最好的脉冲光源 如可锁模的氩离子激光器发射的脉冲宽度为100ps 重复频率可以达到76MHz 脉冲氙灯也可作为脉冲光源用于常规的荧光仪器中 Perkin Elmer公司和Varrian公司的荧光光度计就采用了这种光源 后者的使用寿命达20000小时 ns级脉冲氙灯提供的脉冲宽度在100ps s范围 s级脉冲氙灯可以提供宽度为 s ms s的激发脉冲 能够满足磷光的时间分辨测量 Solid statelightsources1 Light emittingdiodes LEDs areavailablewhichprovideoutputoverawiderangeofwavelengths LEDsareratherinexpensive LEDsaresolid statedeviceswhichrequirelittlepowerandgeneratelittleheat LEDscanbeplacedclosetothesamples 2 Laserdiodesemitmonochromaticradiation Laserdiodesareavailablewithwavelengthsrangingfrom630to1500nm evenshorterwavelengths Laserdiodesareconvenientbecausetheoutputiseasilyfocusedandmanipulated 荧光计上配备有两个单色器 一个是激发单色器 一个是发射单色器 因此可以记录激发和发射光谱 单色器由两个狭缝 即入射狭缝和出射狭缝 和色散装置组成 色散装置多使用光栅 很少采用棱镜 单色器输出的光强度与狭缝的宽度的平方成正比 采用较宽的狭缝 光的强度较高 但是波长的分辨率较差 采用较窄的狭缝 可以提高分辨率 但是要牺牲部分光强度 Planeorconcavegrating 2 1 2MONOCHROMATORS 与棱镜相比 使用光栅的优点是光栅在所有波长范围内有一致的分辨率 但也有不足之处 采用光栅会产生二次甚至三次散射 当荧光比较弱时 这些高级次次的散射光就会被检测出来 First andsecond orderdiffractionoffadiffractinggrating Theregionwherethereisnooverlapofthefirst andsecond orderdiffractioniscalledthefreespectralrange 2 1 3样品池 样品辐射方式反射直角30 60度透射直角 10 10mmcuvette cell QuartzorGlass Flowcell 固体样品架a F4500荧光光度计固体样品架 1 样品室 2 弹簧 3 固定螺丝b 自行设计的用于MPF4荧光仪的固体样品架 滤纸放置在铜片做成的样品架上 样品架的位置由旁边套管上的铜柱固定 而旋转筒磷光计的旋转筒就在铜套内 图2 17磷光镜a圆筒式切光器b片式切光器1 样品管2 杜瓦瓶 光电倍增管 photomultiplierTube PMT RTPred sensitivePMT R928 mammadzu Photon countPMT二极管阵列 diode arraydetector DAD 电荷耦合器件 CCD couple chargeddevice 2 1 4Detectors 模拟型PMT 模拟信号是光子流量的大小 取各个脉冲所贡献的平均值 检测灵敏度或增益随着加到打拿极上的高压的大小而变化 电压增大100V 信号强度增强3倍 因此要求高压电源非常稳定 在较强的发光信号测量中采用这种模式 光子计数PMT 对于很弱的发光 可以采用光子计数法测定 光子计数是在理论极限灵敏度下检测和计数每个光子引起的阳极脉冲 灵敏度不受电压的影响 由于信号较弱 需要进行多次扫描取平均值 2 1 5常见的商品仪器 F 4500荧光磷光化学发光分光光度计 VarrianCaryEclipse荧光光度计 P ELS 55荧光光度计 相同档次的还有 美国Jobin Yvon Fluoromax 3一体化荧光光度计 Dual channelConfocalLifetimeImaging FluorescenceCorrelationSpectroscopyImagingindividualmoleculestoquantifytheirinteractions EdinburghInstrument公司FLS900系列荧光光度计具有很强的时间分辨测量的功能和极高的灵敏度 图2 17是该公司FLS920P荧光光度计 仪器的光源采用ns闪光灯 450W氙弧光灯 能够提供ns级的脉冲 因此可以进行100ps 50s寿命荧光或磷光的时间分辨分析 仪器的光谱分辨率为0 05nm 能够有效地消除散射光的干扰 检测器采用了单光子