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分子生物学常用技术 第十七章 分子生物学常用技术 凝胶电泳分子杂交聚合酶链反应 PCR 技术DNA的物理图谱DNA序列测定基因芯片 第一节凝胶电泳 gelelectrophoresis 电泳概念基本原理Q 6 r 迁移率Q 电荷量r 粒子半径 分子量 介质粘度 电泳的用途分离鉴定纯度测定分子量凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 一 琼脂糖凝胶电泳 agarosegelelectrophoresis 分离核酸原理操作要点应用范围 一 分离核酸原理 电荷效应分子筛效应分子构象 1 电荷效应 核酸是两性电解质pH 3 5 正电荷pH 8 0 8 3 负电荷 正极 2 分子筛效应 小分子移动快 大分子移动慢 3 分子构象 闭环超螺旋 线状DNA 开环DNA 二 操作要点 支持物凝胶浓度的选择DNA分子量标准电泳缓冲液样品制备电泳条件DNA电泳染色DNA片段的回收 1 支持物 商品化的琼脂糖 琼脂糖种类 2 凝胶浓度的选择 凝胶的制备 3 DNAmarker DNAmarker DNA长度标准曲线 4 电泳缓冲液 Tris 乙酸 TAE pH8 0Tris 硼酸 TBE pH8 0Tris 磷酸 TPE pH8 0 5 样品制备 上样缓冲液50 甘油 蔗糖0 5 溴酚蓝 二甲苯青 点样 6 电泳条件 潜水电泳恒压电泳低压 1 2V cm中压 8 10V cm高压电泳 几十V cm温度 15 25 潜水电泳 7 电泳染色 溴乙锭 ethidiumbromide EB 结构及染色原理染色方法加入凝胶液中电泳结束后染色 EB染色原理 紫外灯下显色 8 DNA片段的回收 低熔点琼脂糖法透析袋电洗脱法 5kb DEAE 纤维素膜法 0 5 5kb 三 应用范围 DNA的分离 纯化和鉴定限制性酶切图谱分析重组体的分离 鉴定杂交分析PCR产物的分离鉴定 琼脂糖凝胶电泳 二 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis PAGE 分离原理操作要点优点应用范围 一 分离原理 电荷效应分子筛效应 PAGE支持物 单体 丙烯酰胺 Acr 交联剂 甲叉双丙烯酰胺 Bis 催化剂 过硫酸胺 AP 加速剂 N N N N 四甲基乙二胺 TEMED 聚丙烯酰胺凝胶 二 操作要点 凝胶的分类凝胶浓度的选择凝胶液的配制凝胶中DNA的检测DNA片段的回收 1 凝胶的分类 非变性凝胶 dsDNA变性凝胶 ssDNA尿素甲酰胺SDS 2 凝胶浓度的选择 3 凝胶液的配制 PAGE装置 电泳 4 凝胶中DNA的检测 溴乙锭染色法银盐染色法甲醛还原放射自显影法 Ag DNA Ag 黑褐色 5 DNA片段的回收 压碎浸泡法 1kb纯度高 回收率低 三 PAGE优点 机械强度好 化学稳定性高分辨率高载样量大回收的DNA纯度高 四 PAGE应用范围 分离 纯化和鉴定RNA和小分子DNADNA序列分析PCR产物鉴定蛋白质的检测和分析 第二节分子杂交 分子杂交的基本原理固相支持物探针几种常用杂交技术 一 分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性 分子杂交 DNA DNA DNA RNA 杂交条件 靶分子探针杂交袋杂交炉 杂交种类 被检核酸种类和方法原位杂交斑点杂交Southern杂交Northern杂交Western杂交反应介质液相杂交固相杂交 二 固相支持物 固相支持物的特性结合能力强不影响杂交反应结合牢固非特异性吸附少机械性能良好 固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜 nitrocellulosefiltermembrane 尼龙膜 nylonmembrane 1 硝酸纤维素滤膜 特点吸附ssDNA和RNA杂交信号本底低不足不适于重复杂交滤膜较脆不适于电转移印迹法对DNA小片段 200bp 结合能力弱 2 尼龙膜 特点结合能力强可反复杂交韧性强适于电转移印迹法对DNA小片段 10bp 结合能力强不足杂交信号本底较高 分子生物学考试 时间 2005 1 11 晚7 00 9 00 地点9教讲演厅 150人 9 2 1 50人 9 2 2 50人 9 3 1 50人 答疑 1 10 9 00 11 30 3 00 5 30 地点 逸夫楼3楼生化实验室 三 探针 probe 探针的概念探针的类型标记物的种类标记方法 1 探针的概念 特异结合和检测靶分子的活性物质抗原 抗体配体 受体同源DNA RNA 2 探针的类型 基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针蛋白质或多肽探针 3 标记物的种类 放射性同位素 32P 3H 35S 125I 14C 非放射性标记物生物素地高辛荧光素酶 4 核酸探针的放射性标记方法 DNA缺口平移标记法随机引物标记法DNA的5 末端标记 缺口翻译 特点均一标记制备dsDNA探针 随机引物标记法 randompriming 随机引物6nt含有各种可能的排列顺序特点放射比活性 缺口翻译操作简便DNA cDNA探针 DNA的5 末端标记 5 endlabeling 碱性磷酸酶 T4多核苷酸激酶标记原理制备寡核苷酸探针制备短的DNA RNA探针 DNA的5 末端标记 四 Southern杂交 Southernblotting DNAblotting1975年 EdwenSouthern等印迹 blotting 转移blot aspotormark esp ofinkblotting 1 印迹的方法 毛细管转移法电转移法真空转移法 毛细管转移法 电转移法 真空转移法 2 Southern杂交的步骤 3 Southern杂交的应用 基因的定性及定量分析基因的酶切图谱分析基因突变分析RFLP 五 Northern杂交 RNAblotting步骤总RNA mRNA 变性电泳分离 转移 杂交 放射自显影 化学显色应用检测组织 细胞中mRNA的大小 量比较不同组织 细胞中基因的表达情况 Northern杂交 六 Western杂交 免疫印迹 immunoblotting SDS PAGE 转移 蛋白 第一抗体 标记的第二抗体 探针 检测应用 蛋白质的定性定量分析 免疫印迹 Southern Northern Western 七 原位杂交 insituhybridization 定义种类细胞内原位杂交组织切片原位杂交基本程序细胞 组织固定 预杂交 杂交 冲洗 杂交信号检测 分析结果 组织切片 八 斑点杂交 dothybridization 第三节PCR技术 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR PCR的发展简史PCR的基本原理和步骤PCR的影响因素PCR的种类PCR的应用 一 PCR的发展简史 1971年 Korana提出核酸体外扩增的设想1985年 Mullis等发明了PCR技术1988年 PE Cetus公司推出了第一台PCR仪 二 PCR的基本原理和步骤 基本原理 DNA复制三个步骤变性 denaturation 退火 annealing 延伸 extension PCR的原理 PCR的扩增产物 标准的PCR反应体系 10X扩增缓冲液 10ul模板DNA 0 1 2ug引物 各0 2 1umol L4种dNTP 各200umol LMg2 1 5mmol LTaqDNA聚合酶 2 5U总体积 100ul 三 PCR的影响因素 模板引物TaqDNA聚合酶4种dNTPMg2 循环条件 模板 DNARNA cDNA对模板的纯度要求低 引物 长度 15 30ntG C含量 40 60 碱基的随机分布避免引物自身和引物之间的互补引物的3 端引物的5 端引物浓度 0 2 1umol L TaqDNA聚合酶 2 5U 100ul 20 保存最后加 底物 4种dNTP的浓度相等终浓度 200umol L Mg2 浓度 1 5 2 0mmol L过高 非特异扩增过低 反应产物减少 循环条件 变性温度和时间 90 96 30 60s退火温度和时间 40 60 30 60sTm 4 G C 2 A T 延伸温度和时间70 75 72 1kb 1min 3 4kb 3 4min 10kb 15min循环次数 25 35 四 PCR的种类 反转录PCR原位PCR insituPCR 实时PCR realtimePCR 重组PCR recombinantPCR 锚定PCR anchoredPCR 反向PCR inversePCR 原位PCR 原位杂交 PCR程序固定细胞 组织样品 PCR前处理 PCR扩增 原位杂交及检测 实时PCR的原理 五 PCR的应用 分子生物学研究临床医学 分子生物学研究 基因克隆DNA序列测定基因的体外定点突变突变分析 PCR SSCP 基因定量 临床医学 病原体诊断遗传病的基因诊断肿瘤检测法医学 第四节DNA序列测定 Sanger双脱氧链终止法 1977 Maxam Gilbert化学裂解法 1977 Sanger双脱氧链终止法 原理 DNA复制反应条件模板引物dNTP 其中一种带放射性标记 ddNTPDNA聚合酶 DNA的复制 2 3 双脱氧核苷酸 ddNTP DNA测序操作 DNA自动测序 DNA自动测序仪 第六节生物芯片 Biochip 20世纪90年代末生物分子之间相互作用的特异性种类细胞芯片 组织芯片 微生物芯片 基因芯片 蛋白质芯片 基因芯片 概念种类应用领域表达谱基因芯片及其检测原理应用举例 什么是基因芯片 基因芯片 Genechip DNAchip 又称为DNA微阵列 DNAMicroarray 是指固定在载体上的高密度DNA微点阵 具体地说就是将大量寡核苷酸或cDNA有序地 高密度地排列在玻璃 硅等固相载体上 基因芯片 芯片的制备 基因芯片