蛋白质、多肽类药物质量控制ppt课件

蛋白质 多肽类药物质量控制 生化室2018 4 13上海 蛋白质 多肽类药物 由50个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质 所以蛋白质和多肽没有明显的区别 优点 生物活性高 特异性强 毒性低 缺点 稳定性差 容易失活 大分子 多组分 奥曲肽 醋酸戈那瑞琳 太难 蛋白质 多肽药物质量控制 1 鉴别2 检查3 含量测定 1 鉴别 1 1化学反应1 2高效液相色谱 保留时间 1 3红外光谱 去氨加压素 1 4紫外光谱1 5肽图分析 重组肽 1 6核磁共振 缩宫素 戈舍瑞林 1 7毛细管电泳 重组肽 1 8液质联用 去氨加压素 1 9圆二色光谱 测定蛋白质二级结构 1 10比旋度等 1 5肽图分析 中国药典 2015年版四部通则3405肽图检查法第一法胰蛋白酶裂解 反相高效液相色谱法供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解 终止反应后 离心取上清 液相C18或C8柱 0 1 三氟乙酸的水和0 1 三氟乙酸的乙腈梯度淋洗 检测波长214nm 第二法溴化氰裂解 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 供试品图谱与对照品图谱进行比较 即得 事实是基本做不出来一样的 肽图分析存在的问题 系统适用性在哪里 实验中复杂的前处理过程如何重现 粗犷的规定如何统一判定尺度 向抗生素和中药学习 规定特征峰 给出标准图谱 去溶剂峰 引入相似度评价 给出推荐色谱柱 给出积分条件 空白溶液制备方法等 2 检查 2 1氨基酸分析2 2分子量与分子量分布2 3有关物质2 4热原2 5残留溶剂 2 1氨基酸分析 2 1 1酸水解6mol L盐酸 110 真空 20 24小时 优点 氨基酸不消旋 缺点 色氨酸被完全破坏 天冬酰胺和谷氨酰胺完全水解 胱氨酸不能直接测定 2 1氨基酸分析 2 1 2碱水解5mol L氢氧化钠溶液 充氮封管 110 22小时 优点 色氨酸稳定 缺点 氨基酸外消旋化 多数氨基酸被破坏 2 1氨基酸分析 2 1 3酶水解一组蛋白酶 优点 条件温和 氨基酸不消旋 不被破坏 缺点 水解不完全 2 1氨基酸分析 2 1 4柱后衍生化色谱柱分离后与衍生化试剂 茚三酮 荧光胺 反应 优点 容易定量和自动化操作 缺点 灵敏度低 需要额外设备 峰展宽 分辨率低 2 1氨基酸分析 2 1 5柱前衍生化氨基酸先于化学偶联试剂 邻苯二甲醛 苯氨基甲酰等 反应 再分离检测 优点 灵敏度高 分辨率高 普通HPLC即可分析 缺点 部分衍生物不稳定 副产物干扰分离检测 番外篇 氨基酸类药物的有关物质研究 目前 中国药典 2015年版对于氨基酸类制剂的杂质控制是测定 其他氨基酸 采用TLC法喷茚三酮试液显色 其他杂质如何控制 难点 种类多 分子量小 弱紫外吸收 两性电解质 溶解性差异大 杂质来源 不稳定氨基酸 高温灭菌 生产工艺差距 2 2分子量与分子量分布 2 2 1分子排阻色谱 2 2分子量与分子量分布 2 2 2SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 2分子量与分子量分布 2 2 3ESI MS 2 2分子量与分子量分布 2 2 4MALDI TOF 2 3有关物质 2 3有关物质 2 3 1反相高效液相色谱灵敏 快速 准确 廉价 目前最常用的手段 2 3 2毛细管电泳消耗少 多种分离模式 操作简便 2 3 3液质联用特异性强 极高灵敏度 2 3 4高效分子排阻色谱用于高分子量蛋白物质检查 2 4热原 2 4 1家兔法兔子不稳定2 4 2鲎试剂只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖2 4 3人全血细胞新鲜健康人全血哪来 实验员自己抽 2 4 4人源单核细胞系针对不同热原 内毒素 脂壁酸 酵母多糖等 更适合基质多样的生物大分子的热原检查 2 5残留溶剂 气相 顶空进样最好不用液体进样 堵针 堵进样口 不行就上气质联用 3 含量测定 3 1凯氏定氮法3 2福林酚法3 3双缩脲法3 4BCA法3 5考马斯亮蓝法3 6紫外分光光度法3 7荧光分光光度法 3 8蛋白质印迹法3 9高效液相色谱法3 10毛细管电泳法3 11电位滴定法3 12效价测定3 13氨基酸比值 3 1凯氏定氮法 原理 蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化 使蛋白质分解 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵 然后在碱性条件下蒸馏将铵盐转化为氨 随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收 再以硫酸或盐酸标准溶液滴定 计算出样品中的氮量 由于蛋白质含氮量比较恒定 蛋白质含量 含氮量 16 可由其氮量计算蛋白质含量 3 1凯氏定氮法 3 2福林酚法 原理 在碱性条件下 蛋白质与铜作用生成络合物 蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基将FolIn试剂中的磷钼酸盐 磷钨酸盐中六价钨还原成深蓝色混合物 在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比 3 2福林酚法 3 3双缩脲法 原理 在强碱性溶液中 蛋白质肽键与Cu2 形成紫色络合物 其颜色深浅与蛋白质含量成正比 而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关 测定肽键是真实的测定蛋白质 3 3双缩脲法 3 4BCA法 原理 碱性条件下 蛋白质与Cu2 络合 并将其还原成Cu Cu 与BCA试剂发生络合 使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物 在562nm处吸光度与蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系 2 2 二辛可宁酸 3 4BCA法 3 5考马斯亮蓝法 原理 游离状态下呈红色的有机染料 在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色 最大吸收波长从465nm变为595nm A595与蛋白质含量呈正比 CoomassiebrilliantblueG 250 不能用石英杯 3 5考马斯亮蓝法 3 6紫外分光光度法 原理 酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键 在280nm处有吸收峰 吸光度与蛋白质含量成正比 3 6紫外分光光度法 3 7荧光分光光度法 原理 当溶液中含有表面活性剂时 荧光染料分子之间通过疏水相互作用形成二聚体或多聚体 多聚体的形成导致荧光强度降低 然后加入蛋白质溶液 导致多聚体解聚而使荧光强度增加 在一定蛋白质浓度范围内 荧光信号强度与蛋白质的浓度成正比 3 7荧光分光光度法 3 8蛋白质印迹法 原理 将混合蛋白质进行电泳分离 将产物电转移到硝酸纤维膜上 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原 与对应的抗体起免疫反应 再与酶或同位素标记的第二抗体起反应 经过底物显色或放射自显影检测蛋白成分 3 8蛋白质印迹法 3 9高效液相色谱法 原理 酪氨酸 苯丙氨酸和色氨酸残基在280nm处有