生物物理学PPT课件

生物物理学 Biophysics 生物物理学是由物理学与生物学相互结合而形成的一门交叉学科 它应用物理学的基本理论 方法与技术研究生命物质的物理性质 生命活动的物理与物理化学规律 以及物理因素对机体的作用 生物物理学发展简史 1892年 KarlPearson 科学的方法 20世纪中期 近代生物物理学诞生 50年代X射线衍射对蛋白质测定的应用 生物物理学的内容 分子生物物理学 MolecularBiophysics 生物物理仪器与技术 BiophysicalInstrumentationandTechniques 膜与细胞生物物理学 MembraneandCellBiophysics 理论生物物理学 TheoreticalBiophysics 感官与神经生物物理学 SensoryandNeuralBiophysics 荧光分光光度 Spectrophotofluorimetry 一 荧光的发现二 荧光与荧光光谱三 荧光光谱仪及主要谱参量四 荧光生色团的结构特点五 影响荧光测量的因素六 荧光技术在生物学 医学研究中的应用 荧光分光光度技术 一荧光的发现 1575 N MonardesLignumNephriticum 1852 Stokes分光计植物抽提液 矿物 夜明珠 叶绿素 奎宁 1880 Liebeman最早提出 荧光与化学结构关系 的经验法则为荧光技术的开发应用拉开了序幕 借用萤石的 Fluospar 发光现象而推演 荧光Fluorescence 一 荧光的产生 二 荧光光谱与吸收光谱 二荧光与荧光光谱 一 荧光的产生 1分子的能量状态 在光学分析中涉及的分子能量有 Eo Ee Ev ErEe 价电子运动能 electronEv 原子在平衡位置附近的振动 vibrationEr 分子绕其重心的转动能 rotation其中 Ee Ev Er 一 荧光的产生 2分子的能级EnergyLevels与跃迁Transition 二 荧光光谱与吸收光谱 荧光分光光度术 又称荧光光谱术 属于光谱技术中的一种发射光谱术 其原理是电磁波和物质作用后 物质首先吸收电磁波的能量 然后再重新发射电磁波 激发波段在100 800nm之间 相当于紫外与可见光波段 一 荧光光谱仪 二 荧光分光光度术中的参量 三荧光光谱仪与主要参量 一 荧光光谱仪 二 荧光分光光度术中的参量 ex Maximumexcitationwavelength em max Maximumemissionwavelength 瑞利峰拉曼峰 A荧光强度的定义 在一定激发波长 ex 作用下 发射的荧光强弱 F Ia Ia I0 I I I010 cLF I0 1 10 cL 当C很低时F I0 cL 当C较大时F I0 B 发射光子数 吸收光子数 2荧光强度 fluorescenceintensity F I 与量子产率 quantumyield 二 荧光分光光度术中的参量 荧光强度与浓度的关系 32 荧光偏振 fluorescencepolarization 二 荧光分光光度术中的参量 自然光部分偏振光偏振光 荧光偏振度Fluorescencepolarization p荧光各向异性Fluorescenceanisotropy A 1 荧光偏振度的物理意义 A I I P 0 自然光 荧光分子运动很快 取向随机 稀溶液 B I 或I 为0 P 1偏振光 荧光分子运动很慢 取向有序 C I I 0 0 P 1 生物大分子的荧光属于这种情况 43 2 仪器校正因子G G IHV IHHV vertical H horizontal 3 环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响 A 温度的影响 溶液粘度 A 温度的影响温度升高 P降低B 溶液粘度粘度升高 P升高C 分子的运动 转动 旋转弛豫时间rotationalrelaxationtime 二 荧光分光光度术中的参量 4荧光寿命 Fluorescenceliftime 荧光衰减为原来的1 e所需要的时间I I0e kt 1 k5荧光探剂 1 具有环状共轭双键即 电子系统 2 量子产率随环境变化 而且变化很大 3 能产生稳定荧光的小分子藻胆蛋白phycobiliprotein绿色荧光蛋白GreenFluorescentProtein与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价结合 四荧光生色团的结构特点 1天然荧光生色团的结构特点 1 碳原子骨架 分子具有共轭双键体系 大多含有芳香环或杂环任何有利于提高 电子共轭度的结构改变 都将提高荧光效率 例如 对苯基化 间苯基化等 2 分子的几何排布 具有刚性平面结构 荧光素 酚酞 四荧光生色团的结构特点 4 取代基的位置 邻位 对位 荧光增强 间位 荧光减弱 CN基例外 5 环境 溶剂 温度及pH等均会影响分子结构 从而影响荧光 四荧光生色团的结构特点 3 取代基的类型 1 加强荧光的基团 给电子取代基 NH2 NHR OH OR CN OCH3 OC2H5 2 减弱荧光的基团 得电子取代基 CO2H COOH C O NO2 NO SH F Cl Br I 3 影响不明显的基团 R SO3H NH3 2蛋白质和核酸中的荧光生色团 Tryptophan W Trp Phenylalanine F Phe Tyrosine Y Tyr 四荧光生色团的结构特点 亚硝基奈酚 Tyr茚三酮 Cu2 pH5 8 Phe ex 460nm em 570nm ex 365nm em 515nm 四荧光生色团的结构特点 41 五影响荧光测量的因素 1光化分解 photodissociation 光照后导致化学键断裂 荧光减弱2淬灭 quenching 温度淬灭 温度系数 温度升高淬灭增多浓度淬灭 20内滤光效应 innerfiltereffect 3 杂质淬灭 3O21O23溶剂的极性和pH极性降低荧光蓝移DPH 440nm 430nm强度100倍四环素PH 7荧光最强PH 7荧光很弱 六荧光分光光度术的应用 1 物质的检测1 测量原理 稀溶液 F I0 cL2 结构特点 含有 芳香环 结构3 灵敏度 10 7 10 8g ml 2 蛋白质的内源荧光 研究生物大分子构象 3 蛋白质的荧光标记 4核酸的荧光标记 5酶反应动力学的研究 乳酸盐 NAD 丙酮酸盐 NADH H 乳酸脱氢酶 NADH em 450nm ex 340nm 用杀鼠灵滴定HSA Scatchard图 6生物大分子的结合研究 r L Ka n r L L0 LP L0 r P0 ex 320nm em 400nm 7大分子内基团间或分子间距离的测定 荧光共振能量转移 FluorescenceResonanceEnergyTransfer FRET 荧光共振能量转移的三个条件 供体和受体都能发光供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠供体和受体的距离必须小于100 31 7大分子内基团间或分子间距离的测定 Forster公式 E R06 R6 R06 R0 临界距离 E 转移效率 R 基团间距离 E 1 IDA IDIDA 受体存在时的荧光强度 ID 受体不存在时的荧光强度 7大分子内基团间或分子间距离的测定 1 膜流动性DPH P值小 流动性高2 AS 6 AS 9 AS 12 AS高 2 膜渗漏性羧基荧光素 selfquenching 3 膜电位的测量花菁 cyanine 超极化时 荧光强度F下降 缬氨霉素 K 载体Nernst公式 E mV 59log KO KI KO 细胞外浓度 KI 细胞内浓度 8膜生物物理研究 23 4 膜融合机理的研究 1 2 5 膜成分扩散速度的测定 荧光漂白恢复技术fluorescencerecoveryafterphotobleaching FRAP D 扩散系数 光斑半径 1 2 漂白后的荧光值恢复到稳定值的一半所需时间 rD 与光斑形状有关的一个常数 常用探剂 标记脂类 DiI标记蛋白 异硫氰荧光素 FITC 蕊香红 rhodamine D 2 4 1 2 rD 9荧光技术与其它技术的结合 1 显微荧光光度术对细胞内的不同成分进行定性定位或定量 2 流式细胞术荧光 激光和计算机结合 3 激光扫描共聚焦显微镜FRAP 4 光镊 opticaltweezers Fluo 3 Ca2 AM ex 506nm em 526nm 七思考题1荧光产生的机理是什么 2荧光技术研究的生物学样品的主要参数有哪些 量子产率与荧光强度的区别及关系是什么 荧光偏振的意义是什么 3举例说明荧光技术的应用 4 如果婴幼儿体内缺乏使苯丙氨酸转变为酪氨酸的酶时 则苯丙氨酸的含量异常增大而患 苯丙酮尿症 且易引起智力低下 所以 对婴幼儿的该项体查极为重要 但是 由于血液蛋白质中其它芳香氨基酸的影响而难以测出苯丙氨酸的含量 请用本课程所学内容提出一个检测方案 参考资料 1 赵南明 周海梦 生物物理学 北京 高等教育出版社 海德堡