实验三 酵母核酸的制备及成份鉴定

实验三酵母核糖核酸的提取及组分鉴定 先打开水浴锅 温度设置成100摄氏度 一 目的二 原理三 器材四 试剂和材料五 操作六 注意事项 一 目的 了解核酸的组分 并掌握鉴定核酸组分的方法以了解苔黑酚定量测定RNA的方法 二 原理 酵母核糖核酸中RNA含量较多 RNA可溶于碱性溶液 在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀 即得到RNA的粗制品 核糖核酸中含有核糖 嘌呤碱 嘧啶碱和磷酸各组分 加硫酸煮沸可使其水解 从水解液中可以测出上述组分的存在 1 磷酸磷酸与钼酸铵试剂作用生成黄色磷钼酸 磷钼酸中的钼在有还原剂 Vc 存在时可被还原成蓝色的钼蓝 根据此呈色反应即可鉴定磷酸的存在 2 嘌呤碱根据嘌呤碱能与硝酸银产生灰褐色的絮状嘌呤银化合物而鉴定 3 戊糖根据核糖经浓盐酸或浓硫酸作用则生成糠醛 后者能与3 5二羟甲苯缩合而形成绿色化合物而鉴定 脱氧核糖在浓酸中生成 羟基 酮基戊醛 它和二苯胺作用生成蓝色化合物 三 器材 锥形瓶大研钵电子天平离心机恒温水浴锅 注意仪器使用方法离心管平衡 四 试剂和材料 酵母粉0 04MNaOH 95 乙醇 1 5MH2SO4溶液 浓氨水 0 1MAgNO3酸性乙醇溶液 30ml95 乙醇加0 3ml浓盐酸混匀 苔黑酚 FeCl3溶液 将100mg苔黑酚溶于100ml浓HCl中 再加入100mgFeCl3 6H2O 临用时配制 定磷试剂 按顺序以A B C 蒸馏水 1 1 1 2 V V 混匀 现配 A 17 H2SO4 将17ml浓硫酸缓缓加入83ml水中 B 2 5 NH4 6Mo7O24 2 5g NH4 4Mo2O7溶于100ml蒸馏水中 C 10 Vc 10gVc溶于100ml蒸馏水中 用棕色瓶贮存 颜色呈淡黄色时可以使用 如呈深黄或棕色则失效 五 操作 1 酵母RNA的提取 2 3人一份 将4g酵母溶于20ml0 04MNaOH溶液中 先以少量NaOH溶液湿润酵母 并充分研磨 将悬浮液转移到250ml锥形瓶中 在沸水浴30分钟 不时搅拌 冷却后转入离心管进行离心 蛋白质变性沉淀 RNA溶于碱性溶液 离心10min 4000rpm 将上清液倾入10ml酸性乙醇溶液中 待核糖核酸沉淀完全后 离心3min 4000rpm 弃去上清 RNA不溶于乙醇 pI 2 5 用95 乙醇洗涤沉淀 离心3min 4000rpm 弃去上清液 共进行两次 沉淀可在空气中干燥 即为酵母RNA的粗制品 五 操作 2 RNA水解液的制备 取200mg提取的核酸 加入1 5MH2SO410ml 在沸水浴中加热10分钟后制成水解液并进行组分的鉴定 3 RNA组分的鉴定 嘌呤碱 取水解液1ml加入约1ml0 1MAgNO3溶液 然后加入过量的浓氨水 观察溶液的变化 核糖 取1支试管加入水解液1ml 加三氯化铁 盐酸溶液2ml 再加苔黑酚溶液0 2ml 放沸水浴中10分钟 注意溶液颜色的变化 磷酸 取1支试管 加入水解液1ml和定磷试剂1ml 在水浴中加热 观察溶液颜色的变化 浓氨水 FeCl3 浓HCl 定磷试剂在通风柜中 六 注意事项 1 先以少量NaOH溶液湿润酵母 并进行充分研磨 再