实验五DNA的粗提取与鉴定

实验五DNA的粗提取与鉴定,一、目的要求：,1.了解实验原理。2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。3通过本实验培养实验操作能力和观察能力。,二、实验原理,1.DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质当量浓度为0.14molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,三、实验材料及用具,鸡血细胞液（510mL）；95的冷酒精，0.1gmL的柠檬酸钠溶液，2molL和0015molL的NaCl溶液，二苯胺试剂，蒸馏水；烧杯（100mL1个，50mL、500mL各2个），漏斗，试管（20mL2个），玻璃棒，滴管，量筒（10ml、25ml、50ml、100mL、200ml各1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，试管夹。,四、实验步骤,离心得鸡血细胞液5mL10mL,加蒸馏水50100mL（10倍）,充分搅拌510min,单层纱布的漏斗将血细胞液过滤,滤液中加2mol/L氯化钠溶液80150mL,缓缓加入蒸馏水至粘稠物不再增加,充分摇动烧杯,45层纱布（或单层擦镜纸）的漏斗过滤,钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至20mL2mol/L氯化钠溶液中,搅拌溶解,两层纱布的漏斗过滤,加入冷却的体积为滤液2倍的95酒精,玻璃棒搅拌卷起丝状物,DNA的鉴定,DNA的鉴定,取两支20mL的试管，各加入浓度为0.015molL氯化钠溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。,五、注意事项,1制备鸡血细胞液时，要在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。2获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。,3实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要用其滤液，使用的纱布为12层，第2次是要用其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。4实验中有5次搅拌，除最后一次搅拌外，前4次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。,5实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释氯化钠溶液。6实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中，当加入氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中，加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前2次低的多，但还是为溶解DNA。,7在步骤7中，必须使用冷酒精(至少在5以下存放24h)，并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少，可将混合液放入冰箱中再冷冻几分钟。8盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好也是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。,9本实验成功的关键，是保证提取到足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含量少，所以在下列步骤中应特别注意：在步骤1中使用的鸡血的量要在5mL以上。提取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在步骤2中要充分晃动烧杯，在步骤3中加蒸馏水要控制好量，同时应用玻璃棒缓缓搅动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层纱布过滤，在第5步中要充分搅拌，在第7