毛细管电泳PPT课件

2020/4/25,.,1,概述基本原理仪器结构毛细管电泳与质谱联用技术发展趋势,高效毛细管电泳,2020/4/25,.,2,概述,传统的电泳作为一种分离技术,是根据在电场作用下,不同的溶质由于其不同的迁移速率,以不同的迁移速度向其所带电荷的相反方向移动,从而使得不同的溶质得以分离的方法.而毛细管电泳(CE)又称之为高效毛细管电泳(HPCE),则是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，其迅速发展于二十世纪八十年代后期。,2020/4/25,.,3,CE实际上包含电泳、色谱及其相互交叉的内容，是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使得分离分析科学从微升级水平进入到纳升级水平，并使得单细胞的分析，乃至单分子的分析成为可能。与此同时，也使长期困扰我们的生物大分子如糖类、蛋白质等的分离分析，因为CE的产生和迅速发展而有了新的转机。,2020/4/25,.,4,毛细管电泳的特点,1.高灵敏度紫外检测器的检测限可达10-1310-15mol，激光诱导检测器可达10-1910-21mol；2.高分离效能每米理论塔板数可达几百万甚至几千万；,三高二少一广,2020/4/25,.,5,3.高速度通常的分析时间不超过30min。有1.7min内分离19种阳离子及3min内分离30种阴离子的报道；4.样品用量少只需纳升级的进样量；5.分析成本低（消耗少）只需少量（几毫升）流动相，分析过程是在价格低廉的毛细管柱中进行；6.应用范围广可分离小分子（氨基酸、药物等）、离子（无机及有机离子）、生物大分子（蛋白质等）、甚至各种颗粒（如细胞、硅胶颗粒等），具有“万能”分析功能或潜力。,2020/4/25,.,6,毛细管电泳的应用,作为一项新型的分离技术，CE的多种分离模式给样品分离提供了不同的选择机会，这对分离来源复杂的生物样品尤其有利。研究表明，小至无机离子，大到整个细胞，都有可能利用毛细管电泳技术进行分离分析。CE从产生到现在，其应用首先集中在氨基酸，糖类，核酸和蛋白质等生物分子的分离分析上，但是，随着此项技术的不断发展和完善，其应用已逐渐的向医药卫生，食品化工，环境等领域渗透。,2020/4/25,.,7,目前，CE的研究热点包括：DNA的高速测序，蛋白质的高效分离，糖类分析，细胞分析，手性拆分等等。此外，毛细管电泳还可用于物理化学常数的测定，生产工程控制等。,2020/4/25,.,8,历史的简单回顾,瑞典科学家Tiselius在1937年首先提出电泳，创造了Tiselius电泳仪，并建立了移动界面电泳方法。1948年他获得了诺贝尔化学奖。1981年，Jorgenson创立了毛细管电泳技术。1988年美国Bio-Rad公司研制出第一台毛细管电泳仪HPE-100型。1989年在Boston召开首届HPCE专题会议。,2020/4/25,.,9,毛细管电泳发展的历史相当悠久，其发展可以追溯到二十世纪六十年代中期，瑞典科学家Hjerten首先用内径为3mm的石英毛细管进行了电泳分离。后来，Mikkers等首先从理论上研究了电场聚焦现象及其对分离区带扩展的影响，随后在实验上用200m内径的聚四氟乙烯管实现了高效电泳分离，这项研究成为CZE发展史上的第一个重大突破。,2020/4/25,.,10,从二十世纪八十年代初开始，Jorgenson等使用更细的毛细管及内径为75m的熔融石英管做CZE，在30kV电压下每米毛细管的效率高达4105的理论塔板数，这一开创性的成果成为毛细管电泳发展历史上的一个里程碑，从此，毛细管电泳技术开始了突飞猛进的发展。,2020/4/25,.,11,毛细管电泳技术的发展,1.分离模式的发展传统的电泳模式只能用于荷电离子的分离。1984年，Terabe等在CE电解质溶液中加入离子表面活性剂，在溶液中形成离子胶束作假固定相，实现了中性离子的分离，这种模式称为胶束电动色谱（micellarelectrokineticchromatography，MEKC），此后，又相继发展了环糊精EKC，微乳胶EKC等，目前，MEKC已成为应用非常广泛的电泳模式之一。,2020/4/25,.,12,1983年，Hjerten首先将聚丙烯酰胺凝胶毛细管用于CE分析，发展了毛细管凝胶电泳（capillaryelectrophoresis，CGE）。CGE具有极高的分辨本领，可用于蛋白质碎片的分离及DNA序列的快速分析。此后，随着毛细管电泳研究的深入，其它分离模式如毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocusing，CIEF），毛细管等速电泳，毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography，CEC）等分离模式不断引入，极大的拓宽了毛细管电泳技术的应用范围。,2020/4/25,.,13,2.基础理论的深入研究CE涉及许多基本的理论问题，如区带展宽，塔板高度，热效应，电渗流，分离度的优化等，深入的对这些问题进入研究，将极大的推进CE技术的进一步提高与应用。针对这些理论问题，国内外许多学者进行了大量的研究。,2020/4/25,.,14,如Rhodes和Giddings等对影响区带展宽因素进行了定量分析；Andreev等提出了一个数学模型，讨论了电渗流对CE效率的影响；林炳承等也对CE中各种影响区带展宽的因素进行了定量的分析，得到计算CE区带展宽的数学表达式，用计算机对多肽的CE分析进行了全过程模拟。陈义等比较系统的研究了毛细管电泳中存在的理论问题，讨论了电泳过程中物质传输的各种动力和描述方程、区带的迁移过程及其变化，各种影响分离效率的因素，并对毛细管电泳检测器及进样中的理论问题，进行了研究。以上理论的提出，对毛细管电泳的实际应用具有重要的指导意义。,2020/4/25,.,15,3应用领域的不断扩展与传统电泳一样，CE的主要应用领域是生命科学，分离对象涉及氨基酸，多肽，蛋白质，核酸等生物分子，对蛋白质结构分析具有重要意义的肽图，对人体基因工程具有决定性作用的DNA测序等许多当代生命科学中分离分析难题，CE都已涉及。在应用于生命科学的同时，CE近年来已迅速扩展到其它领域，包括食品化学，药物化学，环境化学，毒物学，医学和法医学等，特别是在手性分子和生物大分子的分离方面，CE具有独特的优势。,2020/4/25,.,16,4仪器的不断完善CE技术走向成熟的标志是其分析仪器的不断完善和商品仪器的出现。自1989年出现商品仪器以来，短短几年间，在世界范围内已推出十几种型号的商品化仪器，包括不少自动化性能指标都较完善的仪器，其检测方法也得到了发展，从广泛使用的紫外可见检测，到二极管阵列检测，激光诱导荧光检测，部分仪器还提供了质谱接口。最近，电化学检测，特别是安培检测方法也得到了广泛的应用。,2020/4/25,.,17,高效毛细管电泳仪器（1）,2020/4/25,.,18,高效毛细管电泳仪器（2）,2020/4/25,.,19,高效毛细管电泳仪器（3）,2020/4/25,.,20,相关理论电泳和电泳淌度电渗表观淌度和权均淌度两相分配与权均淌度分离效率与谱带展宽分离度基本原理,2020/4/25,.,21,毛细管电泳相关理论,一、电泳和电泳淌度,电泳是带电粒子在直流电场作用下于一定介质（溶剂）中所发生的定向移动。,2020/4/25,.,22,在电场作用下，带电粒子定向迁移的速度（电泳速度）可用下式表示：,电泳速度,淌度,电场强度,2020/4/25,.,23,电场强度是指单位距离的电压降（V/cm）。,淌度（mobility）是指溶质在单位电场下的迁移速度，即单位电场下的电泳速度。,2020/4/25,.,24,在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测得的淌度称为绝对淌度（absolutemobility）。,绝对淌度是在无限稀释时单位电场强度下带电粒子的平均迁移速度，是该离子在一定溶液中的特征物理常数,2020/4/25,.,25,电场力：,根据流体力学知道，（球型）离子的流动阻力Ff：,离子电荷,溶剂粘度,离子有效半径,2020/4/25,.,26,一定时间后，两种力的作用达到平衡，即FE=Ff，此时离子作匀速运动，电泳进入稳态。,溶液的介电常数,粒子的Zeta电势,2020/4/25,.,27,棒状粒子：,显然，分子半径小，电荷大的离子具有较大的电泳淌度，而分子半径大，电荷小的离子具有较小的电泳淌度。,2020/4/25,.,28,有效淌度（effectivemobility）是实际测出的离子淌度，可表示为：,样品分子中的第i级解离度,活度系数,2020/4/25,.,29,它与带电粒子的电荷、形状、大小、离解度、溶剂化作用，溶剂的介电常数、粘度、pH值和温度有关。,2020/4/25,.,30,电泳分离的基础是建立在各分离组分有效淌度的差异上。,2020/4/25,.,31,二、电渗,电渗流（electroosmoticflow，EOF），简称电渗，是指管内溶液在外力电场作用下整体向一个方向运动的现象。,2020/4/25,.,32,HPCE通常采用的是石英毛细管柱，一般情况下（pH3），硅醇基（SiOH）电离为硅氧基负离子（SiO），使管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合离子（一般为阳离子）被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加高电压时，双电层中的阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中溶液整体向阴极移动，产生电渗流,2020/4/25,.,33,电渗流的大小可用电渗速度和电渗淌度os表示。,一般情况下，电渗流的速度是电泳速度的57倍。,电渗速度,电渗淌度,管壁的Zeta电势,2020/4/25,.,34,三、表观淌度和权均淌度,在毛细管电泳中，同时存在电泳和电渗，若不考虑它们之间的相互作用，粒子在毛细管内的迁移速度应当是电泳速度和电渗速度的矢量和，即：,2020/4/25,.,35,表观淌度,2020/4/25,.,36,组分表观淌度表观迁移速度,正离子中性分子负离子,分离后出峰次序为：正离子中性分子负离子,2020/4/25,.,37,2020/4/25,.,38,四、两相分配与权均淌度,如果特意在毛细管中引入另一相，称为P相，样品在电迁移过程中同时会发生相间分配，其迁移速度或淌度将发生变化，这样改变了的粒子迁移速度和淌度，称为加权平均速度和加权平均淌度，简称权均速度和权均淌度。,2020/4/25,.,39,设相分配过程远快于电泳过程，则有：,容量因子,样品在P相中的分子数,样品在溶剂相中的分子数,2020/4/25,.,40,P相在电场中可静止，也可迁移，运动方向可正、可负。利用引入P相，可使中性组分产生不同的权均淌度，因而解决了中性组分在毛细管电泳中的分离问题。,2020/4/25,.,41,（一）迁移时间tR,五、分离效率与谱带展宽,带电粒子从进样口迁移至检测窗所用的时间，称为迁移时间。,2020/4/25,.,42,（二）柱效和塔板高度,迁移时间,半峰宽,塔板高度,毛细管的有效长度,2020/4/25,.,43,（三）谱带展宽,1.流型,以电场力驱动产生的EOF，与HPLC中靠外部泵压产生的液流不同。EOF的流型属扁平流型或称“塞流”。扁平型的塞子流不会引起样品区带的增宽，是毛细管电泳高效的重要原因。,2020/4/25,.,44,HPLC的流型则是抛物线状的层流，它在壁上的速度为零，中心速度为平均速度的2倍。,2020/4/25,.,45,VanDeemter方程：,空心毛细管柱，则用Golay方程式表示：,涡流扩散项,分子扩散项,传质阻力,2020/4/25,.,46,由于在毛细管电泳中，无固定相和流动相两相，因此不存在传质项，而且速度流型又是扁平的，于是只有纵向扩散项：,扩散系数,2020/4/25,.,47,毛细管电泳特别适合分离生物大分子。,2020/4/25,.,48,2.自热,管径是影响自热的一个重要因素。,理论上：E=50kV/m，c=0.01mol/L，d140m实际应用2575m的毛细管,2020/4/25,.,49,使用小内径、大外径的毛细管，适当降低外加电压、降低缓冲溶液的浓度以及对毛细管恒温等均可以减小温度梯度，提高柱效。,2020/4/25,.,50,3.扩散与吸附（1）扩散,（2）吸附组分与毛细管壁的相互作用主要为管壁对组分的吸附。,2020/4/25,.,51,六、分离度,分离度是指将淌度相近的组分分开的能力。,迁移时间,峰底宽度,标准偏差,2020/4/25,.,52,分离度也可表示为柱效的函数：,不考虑电渗流时：,2020/4/25,.,53,当考虑电渗流时：,2020/4/25,.,54,高效毛细管电泳基本原理,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。,1.经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。,2020/4/25,.,55,2.高效毛细管电泳技术上的重要突破,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高；电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加；高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,2020/4/25,.,56,3.电泳现象与电渗流现象,电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度电泳,电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,2020/4/25,.,57,4.分离过程,电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,2020/4/25,.,58,5.分离类型,八种分离类型毛细管区带电泳（CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。,毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。,2020/4/25,.,59,毛细管胶束电动色谱（MECC）,在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且电渗流电泳，则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。,2020/4/25,.,60,毛细管等速电泳（CITP）电泳型毛细管等电聚焦（CIEF）按等电点分离，属电泳型，要求完全抑制电渗流动。毛细管电色谱（CEC）又称毛细管电动色谱，属非自由溶液色谱型。微乳液电动毛细管色谱（MEEKC）为CZE扩展的色谱型非水毛细管电泳（NACE）属自由溶液电泳型。,2020/4/25,.,61,仪器结构,电压：030KV。分离柱不涂敷任何固定液，紫外或激光诱导荧光检测器（可检测到：10-1910-21mol/L）,2020/4/25,.,62,毛细管电泳仪器系统,毛细管电泳仪主要包括高压电源、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。,2020/4/25,.,63,图毛细管电泳装置示意图1高压电源2检测器3液冷温控毛细管4数据记录系统5缓冲液槽6缓冲液,2020/4/25,.,64,一、高压电源,常用的高压电源为能提供030kV，电流为200300A的连续可调的直流高压电源，为了获得迁移时间的高重现性，操作电压要稳定在0.1%范围内。,2020/4/25,.,65,高压电源要能够切换极性，最好是双极性高压源。,必须注意高压的安全保护问题。,高压源有恒压、恒流或恒功率等方式。最常用的是恒压源。,2020/4/25,.,66,二、进样系统,毛细管内径很小，进样量必须很少，一般进样长度为毛细管总长度的1%2%。进样体积为纳升（nl）级。所以毛细管的进样采用无死体积的进样方法。,2020/4/25,.,67,毛细管的进样是让毛细管直接与样品接触，然后由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中，进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。,2020/4/25,.,68,在毛细管电泳中常采用的进样方式为电迁移进样和流体动力学进样，除此还有扩散进样。,2020/4/25,.,69,1.电迁移进样,进样体积,毛细管的横截面积,进样时间,进样量,样品浓度,2020/4/25,.,70,电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间。通过改变进样电压和进样时间可以控制进样量。其中E是进样动力，取值多在110kV/60cm之间，仅为分离时操作电压的1/51/3。是进样时间，取值通常在110s之间，有时可达1min或更大。,2020/4/25,.,71,电动进样对毛细管内的填充介质没有特别限制，可实现完全自动化，但在电迁移进样中存在一种歧视效应，即电泳淌度大的组分进样量大，电泳淌度小的组分进样量小或不进，会降低分析的准确度和可靠性。,2020/4/25,.,72,2.流体动力学进样,进样量,样品浓度,毛细管两端压力差,毛细管长度,溶液的黏度,2020/4/25,.,73,显然，P和是控制参数，其中P是进样动力，可以通过如下几种方式进行：（a）在进样端加气压（正压）；（b）在出口端抽真空（管尾抽吸，负压）；（c）利用虹吸作用，即所谓的重力进样。,2020/4/25,.,74,P的取值一般在3450Pa（约3447Pa）附近。的取值通常在15s之间，有时可超过60s。,在流体动力学进样中不存在像电迁移进样中的歧视效应。,2020/4/25,.,75,利用重力虹吸进样：,显然，进样量也可由H控制。H的取值通常在520cm之间，多数取10cm，对应的多在530s间取值。,缓冲溶液的密度,重力加速度,毛细管进、出口的液面落差,2020/4/25,.,76,虹吸进样方式一般为没有压力进样功能的仪器系统所采纳。,2020/4/25,.,77,3.扩散进样,扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制。扩散进样时间在1060s间，属普适性进样方法。,扩散系数,2020/4/25,.,78,三、分离系统,分离系统包括毛细管、毛细管恒温系统、电极和缓冲液池。,2020/4/25,.,79,1.毛细管,目前最常用的是厚壁，内径为2575m，有效长度为3075cm的熔融石英毛细管柱。并定期清洗。,2020/4/25,.,80,2.毛细管恒温系统,毛细管温度的控温精度应达到0.1。目前商品仪器配备的恒温系统有高速气流恒温和液体恒温两种。,2020/4/25,.,81,3.电极和缓冲液池,在毛细管电泳系统中，正负铂电极、进样端缓冲液池、检测端缓冲液池和充满运行缓冲液的毛细管构成了一个导电回路。,2020/4/25,.,82,缓冲溶液液面高度控制是保证毛细管电泳分离效率和迁移时间重现性的重要因素。,缓冲液要经常更新，这样有助于提高电泳分离的重现性。,2020/4/25,.,83,（一）紫外检测,四、检测系统,紫外吸收检测是目前毛细管电泳最常用的检测方法，用于检测有紫外吸收的物质。依检测方式的差异，紫外检测器可分为固定波长、可变波长、二极管阵列等类型,2020/4/25,.,84,一般采用柱上检测方式，也可实现柱后检测。质量检测限为10-1310-16mol，浓度检测限为10-510-8mol/L，其特点为通用性好，二极管阵列可提供光谱信息。,2020/4/25,.,85,紫外检测器由光源、光路系统、信号接收和处理系统构成。,2020/4/25,.,86,（二）荧光检测,一般采用柱上检测方式。质量检测限为10-1510-17mol，浓度检测限为10-710-9mol/L，灵敏度高，需衍生化。,2020/4/25,.,87,（三）激光诱导荧光检测,也可采用柱上和柱后两种检测方式。质量检测限为10-1810-20mol，浓度检测限为10-1410-16mol/L，灵敏度非常高，通常需样品衍生化。,2020/4/25,.,88,毛细管电泳的电化学检测器有三个检测模式：安培法、电导法和电位法。,（四）电化学检测,2020/4/25,.,89,安培法测量化合物在电极表面受到氧化或还原反应时，失去或得到电子，产生与分析物浓度成正比的电极电流。,1.安培检测,2020/4/25,.,90,是一种高灵敏度的电化学检测法，质量检测限为10-1810-19mol，浓度检测限为10-1010-11mol/L，灵敏度高，只适用于电活性物质；需要特殊的电化学和毛细管柱改性。,2020/4/25,.,91,电导法和电位法是测量两电极间由于离子化合物的迁移引起的电导率或电位变化。,2.电导检测和电位检测,2020/4/25,.,92,电导检测通用性好，质量检测限为10-1510-16mol，浓度检测限为10-710-8mol/L，但需对样品进行电改性和色谱柱改性。,2020/4/25,.,93,（五）质谱检测,可采用在线检测或离线检测，灵敏度高而且能提供结构信息。质量检测限为10-1610-17mol，浓度检测限为10-810-9mol/L，,2020/4/25,.,94,（六）间接紫外、荧光和安培检测,灵敏度低于直接检测方法，约10100倍，主要应用于无机离子和没有生色团的化合物的检测。,2020/4/25,.,95,典型的毛细管电泳实验步骤,1.将运行缓冲液充满毛细管柱,2.移去进样端缓冲液池，用样品池代替,3.用电动或压力方式进样,2020/4/25,.,96,4.将进样端缓冲液放回,5.毛细管两端加操作电压进行电泳分离,6.分离样品迁移至检测窗检测，数据记录和处理,2020/4/25,.,97,影响柱效的因素及改进方法,热效应：焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于200微安，一般几十微安。,电渗流控制：电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。,使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。,2020/4/25,.,98,色谱柱的选择和使用,固定相内径膜厚柱长当然在实际应用中选择毛细管柱时,需要把以上4个参数加以综合考虑,根据自己的仪器和进样系统方式选择适合于试样分析的毛细管柱。,2020/4/25,.,99,固定相,由于毛细管柱具有高分离能力,在大多数应用在大多数应用方面,有限数目的固定相就能替代几百种在填充柱中使用的固定相。目前可选择近200种固定液,但是使用最广泛的仍是侧链为甲基或被其它基团取代的聚硅氧烷类,如SE-30,OV-1,OV-101,DC-200等。,2020/4/25,.,100,固定相的选择依样品性质而定，一般有如下原则,相似相容原则：从极性、化学官能团和主要差别来考虑。对非极性组分一般选非极性固定液，如麦氏常数（P）为0或+1；中等极性组分选P为+2或+3；强极性组分选P为+4或+5。官能团相同时相互作用力强，选择性高。另外，当组分主要差别为沸点时，选非极性固定液；当主要差别为极性时选极性固定液。麦氏常数法：对照组分结构，比较固定液的相常数，值越大则对分离越有利。,2020/4/25,.,101,通常,固定相热稳定性随着其极性增加而降低,色谱工作者必须特别注意固定相热稳定性极限。这些固定相在室温下粘度不同,又会影响它们的最低使用温度,例如:OV-1(胶状)的最低使用温度为50,OV-101(粘液)的最低使用温度为-50。因此,在室温分离低沸点化合物OV-101较OV-1要好。,2020/4/25,.,102,内径选择内径直接影响柱效、保留特性和样品容量。,ID0.25mm:适合于复杂多组份试样分析,高分离工作的常规柱,与大口径毛细管柱比,负荷量低,柱流失较小,必须采用分流或无分流进样,适合与质谱等高灵敏检测器联用。ID0.32mm:柱效稍低于ID0.25mm常规柱,负荷量大于常规柱的60%。可采用柱头进样,分流/不分流进样,有些情况下还可使用直接进样。ID0.53mm:这种使用广泛的毛细管柱可以替代大部分填充柱,具有近似填充柱的负荷量,与小孔径毛细管柱相比使用更简便,可采用直接进样技术。,2020/4/25,.,103,固定液膜厚,液膜厚度影响柱子的保留特性和柱容量，随着膜厚的增加,对两个流出时间相近的化合物的分离越好,但是固定相的温度上限降低,柱流失增加。因此,毛细管柱液膜厚度(df)是一个重要的柱参数。对于低挥发性高沸物或热敏化合物,往往选用薄液膜柱(df:0.250.5m),主要用于在300以下流出的大部分样品。,2020/4/25,.,104,对于流出温度高于300的高分子量的化合物来说,选用df0.1m薄液膜柱是理想的，而且通常选择较短的柱子(1015m)。对于质谱等高灵敏度检测器通常选用薄膜柱(df:0.10.2m)。中等厚度(1m1.5m)柱主要用于在100200流出的样品。超厚膜(df:35m)柱主要用于低沸点化合物(气体,溶剂,清洁剂等),以便于在较高(高于室温)柱温下分析。它具有较高的试样负荷量,但在高温下流失较大。,2020/4/25,.,105,柱长的选择,分辨率与柱长的平方根成正比，且柱长增加出峰时间加长。小于15m:用于快速分离较简单的样品。2530m:特别是30m柱，最常用于分离10到50个组份的中等至复杂混合物。大于50m:分离大于50个组份或包含有难分离物质对的复杂试样程序升温分析。,2020/4/25,.,106,毛细管柱的正确使用,毛细管柱的寿命与使用载气的纯度、水蒸气含量以及分析样品的性质有关。因此一根柱子合理科学的使用是延长其寿命的最佳办法。在没有载气通过时,柱的固定液热分解较迅速,所以在柱箱升温前应该先通上载气,柱箱冷却后才能把载气关上。大多数情况下,柱的寿命与它的使用温度成反比。采用稍低些的温度上限,可以显著提高寿命,程序升温到较高温度所维持的时间短对柱寿命的影响小。如OV-101使用温度上限为300,但把实际温度上限降到280,可使柱寿命显著延长。根据经验,一般实际使用温度上限可比固定相使用温度上限低20。,如何延长柱的寿命？,2020/4/25,.,107,载气中的水分能透过固定液膜吸在柱管表面上,会取代或破坏固定液膜,所以固定液极性越高,越需要采用干燥的载气，例如SE-30、SE-54等对载气干燥要求不严,而对PEG20M、FFAP,载气干燥就十分重要。而对于那些氧气能氧化的固定液(PEG20M,FFAP)对载气除氧亦很重要。因此,停机使用时,应将排空端密封住,以防空气中的氧气对柱固定液的氧化作用。对于试样溶剂的选择也要注意,如水、甲醇、二硫化碳等有着非常强的置换固定液的能力,因此甲醇不宜用于PEG20M。另外,丙酮往往会引起硅酮降解。,2020/4/25,.,108,毛细管柱的正确使用,一根好的柱子,由于安装不当,可以造成理论塔板数降低,峰形增宽或拖尾,灵敏度降低等。在毛细管色谱中,由于柱体积很小,载气流量很小,微小的死体积将会引起峰拖尾,柱效降低,因此安装时应注意尽可能减少死体积的产生。毛细管色谱柱与不同进样器和检测器的连接,不同公司的仪器均有严格要求,在安装时应特别注意。,毛细管的安装与老化,2020/4/25,.,109,使用新毛细管柱前,首先要对柱子进行老化处理。一般是先在50柱温下保持1h,赶走溶剂,然后以23/min的速度程序升温,当达到固定液允许的最高使用温度时老化4h即可。应当注意的是,一根放置较长时间的柱子,在使用之前,也必须按上述程序进行老化,而不可突然将柱温升至很高,防止柱液膜被破坏。,2020/4/25,.,110,联用技术,毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)是80年代初发展起来的一种基于待分离物组份间淌度和分配行为差异而实现分离的电泳新技术。具有快速、高效、分辨率高、重复性好、易于自动化等优点。质谱分析技术(MS)是通过对样品离子的质量和强度的测定进行定量和结构分析的一种分析方法。具有分析灵敏度高、速度快等优点。这两种技术的联用(CE/MS)技术是近年来发展起来的一种新型分离检测技术。它综合了毛细管电泳的高效、快速与质谱强大的检测功能等优点，广泛应用于生命科学研究各领域，成为分析生物大分子的重要工具之一。,2020/4/25,.,111,仪器结构,任何一种类型质谱仪诸如傅立叶变换离子回旋加速共振质谱(FT-ICR)、飞行时间质谱、离子陷阱质谱和三级四极杆质谱等均可与CE联用，但四极杆质谱与CE联用最常见。在各种CE与质谱联用中，区带毛细管电泳(CZE)最常用。其它如毛细管等电聚焦电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等应用较少。电子喷雾离子化(Electro-sprayIonization，ESl)是质谱首选的离子源。其理由有二：ESI可用于检测多种高质量的带电分子；其次，从CE分离出来的分子经过接口可以直接进入质谱仪。,2020/4/25,.,112,接口技术,CE末端接口是影响整个检测的一个关键因素，所有CE/ESI-MS接口的目标都是为了获得稳定的雾流(Spray-Current)和高效的离子化。由于CE需要较高离子强度、挥发性低的缓冲液，而ESI需要相对较低的盐浓度才能获得好的雾化及离子化，因此接口技术必须优化，使其尽可能提供好的电子接触，同时尽量减少对CE分离效率的影响。此外，对于每一种接口应选择相应的缓冲液。,2020/4/25,.,113,CE/ESI-MS接口的三种类型：,同轴液体鞘流(CoaxialLiquidSheathFlow)无鞘接口液体连接,2020/4/25,.,114,同轴液体鞘流,此种类型接口是最常见的连接CE与ESI-MS的方法。该接口是一个同心的不锈钢毛细管套在电泳毛细管末端，鞘内充有鞘液。再在此不锈钢套外再套一个同心的钢套，鞘内通鞘气。鞘液与毛细管电泳缓冲液液体在尖端混合，同时被鞘气雾化。鞘液流量通常为每分钟纳升至数微升之间，但却显著高于CE流速。由于鞘液的稀释作用，雾流稳定性得到改善。,2020/4/25,.,115,理想的鞘液缓冲液盐浓度应在高分离(高盐浓度)和高雾化(低盐浓度)间优化。由于鞘液在雾化过程中也完全蒸发，鞘液的稀释并不显著降低检测灵敏度。但混合液体的体积应尽可能小，以避免谱带展宽。,2020/4/25,.,116,无鞘接口,该CE末端做成尖细状以获得稳定的电子雾化。该末端外套一同心套管，内通鞘气。该接口难点是不易同时保持CE和ESI的电路循环。为此，在毛细管末端粘上金丝或镀一层金，但因为金的粘着力差，易被机械的或电子的原因除掉，因而接口性能差且寿命短。,2020/4/25,.,117,近来有人改进了这一接口。他们首先在CE末端镀上一层镍或镍/铬合金，再镀上金，使接口寿命超过100小时。另外有人用铂或镀金不锈钢丝插入CE末端作为毛细管内电极，并以对苯二酚缓冲液为添加剂以抑制电化学反应产生的气泡。此种接口相对于同轴液体鞘流接口，待分析物未被稀释，检测灵敏度要好一些，尤其是与微克级或纳克级电子雾化源相连时。,2020/4/25,.,118,液体连接,该接口为CE末端与一个直径1020m的槽垂直相连，槽内充有CE缓冲液。与CE末端相对的槽的另一端接上ESI。此装置优点在于可通过任意调节槽内液体流速以改善ESI效果，然而这通常是以谱带展宽和分离效能减低为代价取得的。此外，该装置技术难度较大，现仅见于芯片CE与MS联用的仪器。,2020/4/25,.,119,样品预浓缩,CE由于受进样量限制，对一些含量较低的物质检测其灵敏度仍显不足。因此有必要对样品在分离前进行预浓缩。浓缩的方式有三种：在线(On-Line)预浓缩、线内(In-Line)预浓缩、线外(Off-Line)预浓缩。依据浓缩原理有两类：一类是基于电泳的预浓缩，主要有样品堆积(SampleStacking)、场放大进样(Field-AmplifiedInjection，FAI)、等速电泳进样(Isotachophoresis，ITP)等；另一类是基于层析原理的预浓缩，主要有固相吸附层析、液相分配层析、中空纤维层析、免疫亲和层析等。,2020/4/25,.,120,样品堆积,该技术是根据样品塞子与电泳缓冲液导电性差异实现的。若样品的导电性小于缓冲液，样品塞子上的电场强度将相对高于缓冲液，样品塞子中离子的迁移速度将大于CZE缓冲液；若样品以“夹心饼干”方式进行CZE，则待分析物在电泳缓冲液中聚集浓缩。此技术可显著增加样品的输出信号，约达20倍。,2020/4/25,.,121,FAI,FAI类似于样品堆积，也是根据分析物的迁移速度与电泳缓冲液间的差异实现的。唯一差别在于进样步骤和聚集过程。FAI是在整个进样过程都施加电压，而聚集发生在用缓冲液更换样品瓶直到CZE开始的一段时间。此技术可突破样品堆积技术70%毛细管体积进样量限制，可使样品浓缩约100倍，但有进样岐化现象。,2020/4/25,.,122,ITP,ITP既是CE的一种电泳模式又可作为预浓缩的一种方法。用ITP进行预浓缩有两种模式：cITP(Coupled-CapillaryITP)和tITP(Transient-ITP)。cITP是用两根毛细管联结起来，一根用作ITP，另一根用作CZE。cITP仅用于水溶性样品且装置复杂因而并不常用。tITP是一种线内方法，它用同一根毛细管既作ITP又作CZE。tITP包括两个步骤：第一步，待分析物溶解于前导离子(LE)中(通常是氨溶液)，以动力进样方式将样品导入毛细管中。随后将毛细管插入尾随电解质(TE)瓶中(通常为醋酸)，施加一个大约30KV电压在毛细管两端，使LE、待分析物、TE向阴极移动，由于淌度的差别，待分析物被聚集在LE和和TE之间；第二步，用LE作为背景电解质(BackgroundElectrolyte)进行CZE。此技术对蛋白质和阴、阳离子多肽均可进行分析，极具前景。,2020/4/25,.,123,固相吸附层析,该技术有两种方式：固相萃取(SPE)和膜预浓缩。SPE常用C2、C8或C18作吸附剂，萃取床连接在转移毛细管与CZE之间。样品通过转移毛细管进入萃取床，以电泳缓冲液冲洗样品，随后注入50100nl有机修饰剂的塞子使样品洗脱进入CZE系统，随后进行CZE。有机修饰剂可引起样品堆积。此法可显著降低检测限浓度，但使分离度减小、谱带展宽和出现拖尾。为减少此类影响有人用Cg膜作吸附剂，进一步减少萃取床体积，取得很好效果。,2020/4/25,.,124,液液分配层析,液液分配层析预浓缩有两种技术：EE和SLM。EE是根据液液分配层析和电泳而实现的。它有三个步骤：第一步，将样品溶解在非极性溶剂中(如乙酸乙酯)，再将装有LE的毛细管进样端插入样品瓶，以电动方式进样，同时由于液体对流的作用，可避免大量的乙酸乙酯进入区带毛细管；第二步，毛细管插入尾随离子(TE)中，在电场作用下，开始发生聚集。到达稳态后，毛细管插入LE瓶中进行CZE。此法浓缩能力高达1000倍，但蛋白质容易变性和在非极性相中沉淀。,2020/4/25,.,125,SLM是一种线外预浓缩技术，它用一张浸有非极性溶剂(如十一碳烷)的聚丙烯膜，将预浓缩室隔成两个部分，一部分为供相，为样品进入相；另一部分为受相，作为富集相。两相均为水溶性。通过调节二相pH，使分析物在供相中不带电荷，进入受相则带电荷，从而达到浓缩目的。例如对一个碱性离子化合物的浓缩，调节供相pH，使pH高达1012，而受相pH很低(例如24)，因而碱性离子极易以中性分子的形式透过液膜进入受相，而不易从受相扩散进入供相。,2020/4/25,.