基因工程步骤

一、学习目标简述基因工程原理及基本操作过程二、学习重点和难点1、基因工程基本操作程序的四个步骤（重点）2、从基因文库中获取目的基因（难点）3、利用PCR技术扩增目的基因（难点）,1.2基因工程的基本操作程序,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区下游,调控遗传信息的表达(调控序列),外显子(能编码蛋白质),内含子(不能编码蛋白质),启动子,终止子,转录,mRNA前体,成熟mRNA,切除内含子转录部分,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,用3分钟阅读P8-11，并思考下列问题，然后用2分钟与同桌交流、讨论。1、获取目的基因的常用方法有哪些?2、何谓基因文库？其类型有哪几种？3、如何构建基因文库？4、何谓PCR技术？其原理、条件和过程是怎样的？,一、目的基因的获取,1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成,3、基因文库又称DNA文库，将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。按外源DNA片段的来源分基因文库分为：基因组DNA文库：包含了某物种的所有的基因部分基因文库：只包含了部分基因文库（如cDNA文库）,1）载体DNA片段的制备DNA分离纯化限制酶切2）供体DNA片段的制备总DNA分离纯化酶切法分离特定大小DNA片段,3）载体与基因组DNA片段的连接,4）重组DNA转化受体细胞,4.基因文库的构建,基因组文库的构建,通过对受体菌的培养而储存基因,cDNA文库的构建（反转录法）,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),接到载体,基因组文库和部分基因文库的比较,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,思考：怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,根据基因的有关信息如根据基因的转录产物mRNA、基因的核苷酸序列、基因翻译产物蛋白质等来获取目的基因。,2、利用PCR技术扩增目的基因,聚合酶链式反应,PCR,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA双链复制,已知基因的核苷酸序列(前提条件),四种脱氧核苷酸,成对引物,DNA聚合酶(Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR的基本反应步骤,变性90-95C,延伸70-75C,退火55-60C,PCR总结：,3、化学方法人工合成目的基因,基因比较小,已知核苷酸序列，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,二、基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,1、基因表达载体的构建方法,2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代（2）使目的基因能够表达和发挥作用。,3、基因表达载体的组成：,思考：它们有什么作用？,表达载体为什么一定要有启动子？,（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达。（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,终止子的作用是什么？终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,标记基因有什么作用？,1、原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径,三、将目的基因导入受体细胞,2、方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,（1）农杆菌转化法,特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因枪法,单子叶植物适用此方法,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,2、将目的基因导入动物细胞,程序：目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,方法：显微注射法,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,3.将目的基因导入微生物细胞,四、目的基因的检测与鉴定,分子水平检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译个体生物学水平鉴定,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组DNA；,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中。,（一）检测,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,（二）鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出