新型电化学DNA传感器进展PPT课件

.,电化学DNA传感器,邵从英中国科学技术大学,.,化学传感器是一种小型化装置,它能够选择性地,连续地,可逆地感受液体和气体中化学物质的浓度,并将该信息实时地转换为电信号或光信号.一个传感器包括:1.化学敏感层,即识别系统(receptor)2.将化学信息转换为电信号或光信号的换能器(transducer)3.数据处理电子线路,即检测器(detector).换能器是电化学检测器的传感器都可称为电化学传感器.,电压,电阻,电流或电化学发光信号等,.,电化学DNA传感器,利用单链DNA(ssDNA)或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面,加入识别杂交信息的电活性指示剂(称杂交指示剂),共同构成的检测特定基因的装置.其工作原理是利用固定固体电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的同源序列的特异识别作用(分子杂交)形成双链DNA(dsDNA),同时借助一能识别ssDNA与dsDNA的杂交指示剂的电流响应信号的改变来达到检测DNA的目的.电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种全新思想的生物传感器,其用途是检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质(如蛋白质或其它小分子等).,.,电化学DNA传感器基本示意图,.,一般常规检测DNA的方法是先利用凝胶电泳分离不同的DNA序列，再对各组分进行染色以后进行分析检测仪器较昂贵，而电化学DNA传感器因其高的灵敏度、快的响应速度、操作简单、与微加工技术的兼容性好、成本低廉等优点愈来愈受到关注介绍几种不同设计思想的电化学传感器：,.,一直接电化学传感器,最早的电化学传感器：利用在汞电极表面发生的氧化还原反应，很显然，被氧化或还原的的量能反映出被捕获的靶序列的量这种方法很简单，但是背景电流干扰严重直接氧化要求的电位就很大，会导致其它电活性物发生电极反应有人检测前把分析物静电富集后再利用来研究的直接电化学，可以达到很高的灵敏度为了提高信噪比，也有人提出用物理分离法除去背景干扰源如：两步法捕获靶序列将探针固定于磁珠上，与靶序列杂交后，利用磁分离法将磁珠从分析液中分离出来，经酸处理后收集自由的鸟嘌呤和腺嘌呤核苷，再用分析之检测限达femtomoles（个分子）,.,二间接电化学传感器,不是直接通过检测DNA的氧化还原电信号来进行靶序列的分析.而是引用了电活性媒介物杂交指示剂（如metalcomplexes,daunomycin,andmethyleneblue等）它们能选择性的结合在ds链上，来实现靶序列的检测。检测限达attomoles即10-18M,.,DNA传感器制备的基础流程,Au圆盘电极用矾土抛光,再用混合酸清洗,然后再进行电化学处理,用被HS(CH2)6-标记的寡聚核苷酸探针修饰电极表面(既将电极置于250C探针溶液中3h),取出洗涤后,用长链烷基硫醇掩盖电极上未被探针分子结合的位点-烷基硫醇(-HS)在Au上形成SAM,移取2ul靶DNA溶液于已被修饰的电极表面并分布均匀,然后在250C保温适当时间杂交(形成ds-DNA)即完成,将上述电极置于杂交指示剂溶液中10min,指示剂即沉积于电极上,取出洗去表面未被吸附的指示剂.即可用来做电化学响应测试,.,e（）离子的循环伏安图，可知探针的确已被修饰到电极上.另外,在b未被探针修饰的电极上发生的是可逆电极反应,且峰电流在a被探针修饰的电极上发生的是不可逆电极反应；（由氧化还原峰电流之比及氧化还原峰电位差值可知）,.,靶序列与Ss-DNA探针完全配对或错配是的浓度-电流曲线,杂交时完全配对A+B,1个碱基错配A+C,碱基完全错配A+E,2个碱基错配A+D,A:ss-DNAprobeHS(CH2)6-5-d(TAAGGGAATGGTTAGGAAGGC)-3,B:fullymatchedoligonucleotide5-d(GCCTTCCTAACCATTCCCTTA)-3,C:single-basemismatchedoligonucleotide5-d(GCCTTCCTAACTATTCCCTTA)-3,D:double-base-mismatchedoligonucleotide5-d(GCCTTCCTAACTCTTCCCTTA)-3,E:fullymismatchedoligonucleotide5-d(CTTGATACGGATCAGAGTCAT)-3,.,u(bpy)3e-u(bpy)33来催化G（鸟嘌呤）的氧化反应,通过检测u(bpy)3的特征氧化电流来实现靶序列的测定,电活性媒介物-电子转移介体,例1,.,DNA的”三明治”电化学检测法(需要分子标记,但同时使多靶序列检测-传感器阵列成为可能.检测限达femtomoles即10-15M,靶序列,捕获探针,指示探针,二茂铁标记,探针修饰磁珠,靶序列,纳米硫化物颗粒(三者还原电位不同),三明治结构,Sensorarray,例2,.,杂交时碱基完全配对,杂交时含不配对碱基(电流),甲基蓝,亚甲基蓝,当DNA探针与靶子序列碱基完全配对时，碱基发生密堆积，则ds-DNA是良好的电子传输媒介物（不是反应物），甲基蓝被还原成亚甲基蓝，LB与Fe（CN）63-接触,使后者发生还原反应；但当碱基出现错配时，经过ds-DNA的电流就会下降，MB+就不会被还原，催化电信号就消失。此法的灵敏度很高可以检测出单个碱基的错配（包括热力学稳定的G-A错配）。,例3DNA作为电荷传输媒介物的电化学传感器（不需要分子标记）,.,二、电化学DNA传感器的放大检测技术,用DNA探针做分子识别物质，由于它本身的结构特征-两条互补单链(ss-DNA)特异性结合，使得电化学DNA传感器的选择性很好。现在我们考虑一下如何进一步提高电化学DNA传感器的灵敏度，广泛采用的有靶序列的富集，分离技术还有PCR（聚合酶链反应-核酸的体外扩增技术）等。为了更好的了解生命的本质,很多时候要求单细胞水平的生化分析，所以电化学DNA传感器的放大检测技术也很重要，现介绍几种不同思想的DNA放大检测技术：,.,1.基于纳米粒子的DNA传感器的放大检测技术检测限达femtomoleszeptomoles即10-1510-21M,”三明治”结构,形成“三明治”结构以后，加入Ag的对苯二酚溶液，外加电压使Ag还原沉积在Au纳米颗粒上，显然电路中的电阻会急剧下降，据此可实现DN的放大检测。有人在电极板上设计出缺口阵列，并修饰上不同的DNA探针，可实现多个靶序列的检测-即DNA传感器阵列。,纳米Au标记的DNA探针,.,2.基于酶催化的DNA传感器的放大技术,酶修饰的探针,”三明治”结构,酶催化生成的二元聚合物-靛蓝沉淀沉积在电极表面，阻碍了电子在电极与Fe（CN）63-之间的传输，导致电路中电阻急剧增大，通过测量电阻值可实现靶序列的放大检测。,靛蓝沉淀物,.,3.用聚合的金属配合物作杂交指示剂来检测靶序列，其灵敏度比单纯地用金属配合物作指示剂来检测DNA，灵敏度提高1000倍。（聚合效应及熵效应）,Os(5,6-dmphen)2,Os(bpy)2,邻二氮杂菲,二吡啶,杂交指示剂1(邻二氮杂菲为配体)比杂交指示剂2(二吡啶为配体)的检测灵敏度高。因为2仅靠静电力与ds-DNA结合,而1邻二氮杂菲为配体为平面芳香配体与ds-DNA间有堆积与插层效应,.,4.有人提出用酰胺键代替磷酯键合成出一种新的聚合物-PNA,用PNA作探针,它与DNA靶序列的结合比DNADNA的结合还要强,结构更稳定,对碱基序列配对情况的识别能力很强,灵敏度很高，单个碱基错配也能检测出来,而且用PNA作探针实验条件的选择范围也宽些,如Buffer,T等,核肽-PNA,.,三.电化学DNA传感器用来检测蛋白质及其它小分子,蛋白质,电活性指示剂-道诺霉素,ds-DNA,HS-（CH2）6OH,酶蛋白与ds-DNA纠结在一起，因其具有生物催化活性，能切除部分的ds-DNA片段，同时释放出电活性指示剂-道诺霉素，使得检测到的电化学信号下降，进而实现蛋白质的检测。另外，此分析方法也为DNA上酶动力学的实时研究提供依据，因为我们可以了解到不同反应时刻dsDNA被切除的情况，如右图。,.,尽管电化学DNA传感器在临床疾病诊断及环境检测方面已得到应用，并显示了其独特的优越性，但仍存在着挑战/机遇：1.DNA探针的尺寸（目前多为几十个碱基大小）与探针的固定技术等有待提高。2.基因样品的生物复杂性，对前处理如提取与纯化技术有很高的要求。我们的目标是不需要什么扩增技术直接实现低含量靶序列的测定。3.利用此传感器来检测蛋白质将会有更大的复杂性。现在已经进入后基因组计划时期，急需一种高通量的蛋白质筛选检测方法来实现按生物活性给人类蛋白