第八章酵母基因工程详解.ppt

真菌基因工程,一、真菌表达系统的优缺点,二、酵母转化系统,1、酵母宿主系统,用作模式真核生物的酵母宿主菌,酿酒酵母（Saccharomycescereviasiae）：*无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物*繁殖方式与原核类似，易于操作*基因表达调控机理与高等真核类似,用作外源基因表达的酵母宿主菌,酿酒酵母：最成熟的真核细胞表达系统，表达水平低，产物过度糖基化甲醇酵母：可以利用甲醇作唯一碳源，表达水平高，产物糖基化更合理毕赤酵母：巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）汉逊酵母：多型汉逊酵母（Hansenulapolymorpha）其它酵母：已有60多种酵母菌建立了转化系统乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe),抑制超糖基化作用的突变宿主菌,能抑制超糖基化的突变类型,mnn甘露糖生物合成缺陷型,alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型,och外侧糖链添加缺陷型,突变类型,生物效应,许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，,它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖,链两部分组成。,酵母菌普遍拥有蛋白,质的糖基化系统，但野生,型酿酒酵母对异源蛋白的,糖基化反应很难控制，呈,超糖基化倾向，因此超糖,基化缺陷株非常重要。,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型,ssc1改善重组蛋白分泌钙离子依赖型的ATP酶,ssc2提高重组蛋白表达转录后加工,rgr1提高重组蛋白表达转录水平,ose1提高重组蛋白表达转录水平,ssc11改善重组蛋白分泌羧肽酶Y,rho-提高重组蛋白表达转录水平,突变类型,生物效应,作用位点,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,泛素介导的蛋白质降解作用,蛋白酶体,Lys,Ubiquitin76aa,ubiquitinligaseE3,Lys,ubiquitinligaseE3,Lys,靶蛋白,靶蛋白,靶蛋白,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因,酵母菌共有四个泛素编码基因：,UBI1编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭,UBI2编码泛素-羧基延伸蛋白52（CEP52）对数生长期表达稳定期关闭,UBI3编码泛素-羧基延伸蛋白76（CEP76）对数生长期表达稳定期关闭,UBI4编码泛素五聚体对数生长期关闭稳定期表达,酵母菌共有七个泛素连接酶基因：,UBC1、UBC2、UBC3、UBC4、UBC5、UBC6、UBC7,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变株能正常生长。,UBI4缺陷型：,UBA1缺陷型：,UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的,Ubc4-ubc5双突变型：,七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效,人工构建质粒:5种酵母附加型质粒（YEp）酵母复制型质粒（YRp）酵母着丝粒质粒（YCp)酵母人工染色体（YAC）酵母整合型质粒（YIp）,野生型质粒：2m质粒（酿酒酵母）,2、酵母载体系统,酿酒酵母中的2环状质粒,野生型，双链、环状、6kb拷贝数达50至100个,同源重组,REP1,RAF,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,B,IRs反向重复序列，600bp，重组,FLP编码产物驱动IRs的同源重组,REP编码产物控制质粒的稳定性,STBREP的结合位点,接合酵母属中的pSR1和pSB1，以及,克鲁维酵母属中的pKD1等均与2质,粒类似。,人工构建酵母质粒的共同特点,YEp质粒,*复制子：2m质粒来源的ori*拷贝数50-100*不稳定培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。,YRp质粒,*复制子：染色体来源的ARS*拷贝数50-100*不稳定培养几代后，质粒的丢失率高达50%-70%，主要是由于分配不均匀所致。ARS:autoreplicationsequence,YCp质粒,*在YRp中引入CENCEN：着丝粒序列，来源于3号染色体，有丝分裂稳定，低拷贝数*复制子：染色体来源的ARS*拷贝数：1-5,YAC质粒,*在YCp中引入TELTEL：端粒，染色体末端序列，利于线性DNA末端稳定稳定性：随着插入DNA片段的增大而增加用途：大型基因文库构建,YIp质粒,*只有大肠杆菌的复制子*引入酵母基因组的同源序列*载体以同源或非同源重组方式整合入宿主基因组*拷贝数：大多情况下为1个,以酵母标记基因（his3)的5端和3端作同源序列,3用于酵母转化子筛选的标记基因,营养缺陷型的互补基因,显性基因,宿主细胞：为氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变子主要有：LEU-、TRP-、HIS-、URA-载体：携带相应的合成基因如：leu1/leu2、trp1、his3/his4、ura3选择压力：不完全培养基如：YNB、无机盐培养基,营养缺陷型的互补基因,显性标记基因的编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白,显性标记基因,aph氨基糖苷转移酶抗G418,cat氯霉素乙酰转移酶抗氯霉素,dhfr二氢叶酸还原酶抗氨甲喋呤和磺胺,cup1铜离子螯合物耐受铜离子,suc2蔗糖转化酶耐受高浓度蔗糖,ilv2乙酰乳糖合成酶抗硫酰脲除草剂,标记基因,编码产物,遗传表型,4酵母菌转化方法,原生质体转化法,碱金属离子介导转化法,电激转化法,酵母菌原生质体转化法,细胞：去壁的原生质体原理：以PEG等渗缓冲液稳定原生质体，以Ca2+诱导细胞摄取外源DNA。特点：30%以上为多质粒共转化转化效率：可达原生质体总数的1-2%，但操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约。,碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化,细胞：带壁的完整细胞原理：通过碱金属离子（如Li+等）、PEG和热休克处理诱导细胞吸收外源DNA。特点：,吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA，两者相差80倍,共转化现象极为罕见,酵母菌电击转化法,细胞：带壁完整细胞或原生质体原理：通过电脉冲对细胞膜造成DNA摄取通道特点：转化率高（105/mgDNA）、操作简便、适用范围广,5外源DNA在酵母宿主细胞中的命运,单双链DNA均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的10-30倍,含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制,不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体,外源DNA常通过同源或非同源方式与染色体DNA重组,线性化DNA更易于同源重组,三酵母表达系统,甲醇酵母表达系统,酿酒酵母表达系统,其它酵母表达系统,（一）酿酒酵母表达系统,酿酒酵母分泌系统,酿酒酵母系统启动子,酿酒酵母表达系统存在的问题,酿酒酵母糖基化系统,1、酿酒酵母启动子,UAS,URS,TATA,起始位点,编码序列,mRNA,40-120bp,20-40bp,100-1400bp,1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;,DAS,1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH,酿酒酵母表达系统常用启动子,2）半乳糖激酶启动子（GAL1）,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,A、GAL1、GAL7和GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差,半乳糖诱导、葡萄糖抑制,2）半乳糖激酶启动子（GAL1）,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录,半乳糖诱导、葡萄糖抑制,Promoter,GAL10,3）pho4TS-PHO5启动子,A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子,C、pho4TS温度敏感，35时失活，PHO5关闭,D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23）诱导表达,低温诱导、磷酸盐抑制,酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：性结合因子：MF-酸性磷酸酯酶：PHO5蔗糖酶：SUC2杀手毒素因子：KIL,2、酿酒酵母分泌系统,*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：,酿酒酵母信号肽特点,正电荷区,疏水区,极性区,Met,目的蛋白,信号肽剪切位点,*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成,MF-信号肽,Met,目的蛋白,-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-,KEX2,DAP,DAP,DAP：STE13编码的二肽酶,糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化,3、酿酒酵母糖基化系统,*过糖基化（超糖基化修饰）：N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团,酿酒酵母糖基化特点,1）表达水平普遍不高A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）B、所采用的强启动子调控不严谨C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵2）分泌表达产物过糖基化,4、酿酒酵母表达系统的缺陷,酵母菌表达系统的选择,酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油,醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢,酿酒酵母表达系统,酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。,酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得,有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能,大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。,酵母菌表达系统的选择,乳酸克鲁维酵母表达系统,酵母菌表达系统的选择,巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生,巴斯德毕赤酵母表达系统,长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长,迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯,德毕赤酵母表达系统的三大优势。,由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因,的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因,具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。,的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种,酵母菌表达系统的选择,多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被,多型汉逊酵母表达系统,克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载,体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒,能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多,目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获,个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。,得成功表达。,F利用重组酵母生产乙肝疫苗,7酵母基因工程,由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重,的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其,中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒,还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒,感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其,广泛应用提供了可靠的保证。,F利用重组酵母生产乙肝疫苗,7酵母基因工程,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,乙型肝炎病毒的结构与性质,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒,乙型肝炎病毒的结构,颗粒呈球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的主要,结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化,和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（HBcAg）、,除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22,病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。,nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的,1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因,ATG,ATG,ATG,TAA,108aa,55aa,226aa,preS1,preS2,S,S多肽,226aa,M多肽,281aa,L多肽,399aa,乙型肝炎病毒的结构与性质,乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫,传统乙肝疫苗的制备,苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的,疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,20世纪80年代开始选择酿酒酵母表达重组HBsAg，主要工作包括,将S多肽