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第七届“挑战杯”广东省大学生课外学术科技作品竞赛获奖作品魔芋胶与大豆分离蛋白相互作用研究 *本作品获第七届“挑战杯”广东省大学生课外学术科技作品竞赛二等奖丁金龙 指导老师：孙远明 吴 青（食品学院，华南农业大学，广东广州，510642）摘 要：以魔芋胶与大豆分离蛋白为试材，研究两者之间的复合增稠性、乳化性及胶凝性，并对两者之间的作用机理进行了探讨。结果发现魔芋胶与大豆分离蛋白复配具有明显的协同增稠作用；魔芋胶对低浓度大豆分离蛋白的乳化性能具有显著的改善作用；魔芋胶与大豆分离蛋白复配具有较好的胶凝作用。显微结构观察表明魔芋胶与大豆分离蛋白复配后两者胶束间发生一定的相互作用；红外光谱分析表明复配后两者分子上的化学基团没有发生本质上的改变，但氢键作用增强；复配凝胶体系中作用力的研究结果表明体系中作用力主要为氢键作用，从而说明魔芋胶与大豆分离蛋白主要是通过分子间氢键发生作用。关键词：魔芋胶；大豆分离蛋白；增稠；乳化；胶凝；作用机理魔芋（konjac）为天南星科（Araceae）魔芋属（Amorhophallus Blume）多年生草本植物，在我国主要分布于四川盆地、云贵高原、陕西南部、湖北西部和湖南等地的山区，资源十分丰富，是世界魔芋的主产地。2001年全国魔芋栽培面积110万亩，鲜魔芋年产数百万吨，是山区的主要经济作物，已成为贫困山区脱贫致富的主要资源和经济支柱。魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan），俗称魔芋胶（konjac gum），为天然高分子多糖，是魔芋块茎的主要成分。它具有极高的吸水溶胀能力，溶液具有很高的粘度，在碱性、加热条件下能形成热不可逆凝胶。作为一种优良的水溶性膳食纤维，魔芋葡甘聚糖具有优异的保健功能，可预防和治疗高血压、高血脂、心血管病症、糖尿病、肥胖、便秘、结肠癌等症1。由于其独特的流变学性质和优良的保健功能，因此魔芋葡甘聚糖作为原料或添加剂，在食品工业中已得到日益广泛的应用，国际上对其需求量也越来越大。大豆分离蛋白（soybean protein isolate）是一种高纯度大豆蛋白产品，蛋白质含量高达90%以上。它具有两大特性：一是很高的营养价值；二是诸多加工功能，如乳化、吸水、吸油、粘结、胶凝、发泡、成膜等，可以改善食品的质量2，3，是一种应用较广泛的食品工业原料和添加剂。但也存在一些功能缺陷或由于生产过程而导致性能下降，如溶解性差，性能不太稳定等，不能充分满足现代食品加工的要求。因此，加强或改善大豆蛋白的功能特性，成为食品工业中一个亟待解决的问题。目前关于魔芋葡甘聚糖与大豆蛋白的复合，已有一些应用上的研究，如Koo4将魔芋粉与大豆分离蛋白、瘦肉复合制低脂肉糜。但系统研究魔芋葡甘聚糖与大豆蛋白相互作用及机理的，尚鲜见报道。因此，本研究选用魔芋胶与大豆分离蛋白作为基材，研究两者间的相互作用及其作用机理，拟将两者复合，进行优势互补，以期进一步开发利用我国丰富的魔芋和大豆蛋白资源。1 材料与方法1.1 材料及仪器魔芋胶（简称KG，深圳市协力食品有限公司），大豆分离蛋白（简称SPI，黑龙江省三江食品公司），黄原胶（xanthan gum，简称XG，江苏金坛），瓜尔豆胶（guar gum，简称GG，印度），花生油（广州粤皇食品有限公司），氢氧化钙（分析纯），氯化钠（分析纯），脲（分析纯）。FA2104上皿电子天平（上海），JB90-D型强力电动搅拌机（上海），电热恒温水浴锅（上海），PHS-3C型酸度计（上海），NDJ-1型粘度计（上海），JB-3J型定时恒温磁力搅拌器（上海），PHILIPS HR1700/07捣碎机，TDL-5型低速台式大容量离心机（上海），油标卡尺（上海），手提式压力蒸汽灭菌锅（广州），TA500质构仪（英国），JSM-T300扫描电子显微镜（日本电子），RFX-65A傅里叶变换红外光谱仪（美国Analect公司）。1.2 实验方法1.2.1 粘度的测定配制150mL溶胶样液，强力电动搅拌机搅拌均匀，25恒温水浴静置5h，使用NDJ-1型粘度计测定粘度。1.2.2 乳化值的测定参考赖小玲5和蔡立志等人6的方法，并稍作改变。配制100ml样液，在定时恒温磁力搅拌器上搅拌30min，取50ml样液于PHILIPS HR1700/07捣碎机，再加入50ml花生油，1档匀质0.5min，静置1min，再匀质0.5min，2000r/min离心5min，用油标卡尺测量离心管中总的液体高度和乳化层高度，每样重复3次，计算出乳化值。乳化值（%）=乳化层高度/总液体高度1001.2.3 凝胶强度的测定使用质构仪测定，直径12mm的圆柱压头，压头下降速率60mm/min，Trigger为0.5N，3次重复。1.2.4 凝胶粘着性的测定使用质构仪测定，直径12mm的圆柱压头，压头下降速率60mm/min，Trigger为0.05N，固定压力2.00N，保持10.0s，3次重复。1.2.5 扫描电子显微镜观察溶胶样品用滴管垂直滴于样品铜台，立即投入液氮速冻，以便形成柱状；凝胶样品切成小长方柱形，用固定胶粘于样品铜台，将铜台投入液氮中速冻。然后将样品铜台送入电镜中，轻轻碰断样品柱而形成断面，观察并选择有代表性的视野拍摄。1.2.6 红外光谱分析采用溴化钾压片法，溶胶样品先经涂膜烘干，然后再置于样品池中，以空气为参比，用红外光谱仪进行检测。2 结果与分析2.1 KG与SPI的复合增稠性2.1.1 KG与SPI的复合增稠作用不同SPI浓度下SPI及SPI-0.5%KG体系粘度如表1所示。不同KG浓度下KG及KG-2.0%SPI溶胶体系的粘度如表2所示。表1 不同SPI浓度下SPI及SPI-0.5%KG体系粘度比较表SPI (%)00.51.02.03.04.05.06.0粘度(mPa.s)SPI5.06.57.58.510.016.050.0SPI-0.5%KG270057006100650014300168002450034500V复配/（VKG+VSPI）1.002.112.252.405.286.209.0212.54表2 不同KG浓度下KG及KG-2.0%SPI体系粘度比较表KG (%)0.000.100.200.300.501.00粘度(mPa.s)KG10.562.5350270037000KG-2.0%SPI7.530.0247.51340650054500V复配/（VKG+VSPI）1.001.673.543.772.401.47注：表中V复配、VKG、VSPI、分别表示复配胶粘度、KG溶胶粘度、SPI溶胶粘度相对KG而言，单独SPI体系的增稠性很差。在0.5%KG溶胶中添加SPI后体系的粘度有很大的变化，复合体系的粘度显著上升，超过KG和SPI单独溶胶体系粘度之和，且随SPI添加量的增加，其粘度与KG及SPI单独溶胶体系粘度之和的比值上升幅度越大（表1）。在2.0% SPI溶胶中添加KG，随KG浓度的增加，复合体系的粘度亦呈明显上升趋势，不过复合体系的粘度与KG及SPI单独溶胶体系的粘度之和的比值则先随KG浓度的增加而上升，当KG达0.30%时，比值达最大值，此后逐渐下降（表2）。综合表1和表2的结果，说明KG与SPI之间存在着协同增稠作用。2.1.2多因素组合对复合体系增稠性影响保持KG浓度0.5%、SPI浓度2.0%，研究pH、氯化钠、温度对该复合体系粘度的影响，实验采用均匀设计表U12（1226）7。结果见表3。表3 多因素对复合体系乳化性能组合影响结果pHX1氯化钠（mol/L）X2温度（）X3粘度（mPas）标准误20.1070310036.324231.0050562026.034240.0890220023.333350.8060492030.550560.0625668035.276770.6080420072.721780.0450668037.859490.4090242020.2759100.0270480060.0925110.2025520054.8483120.0180100034.1971130.1560 10 0.1155运用SAS统计分析软件对实验结果进行回归分析，建立粘度与各参试因子的回归模型：Y=2866.7663+1525.4554X1-117.7850X1*X1-0.5457X3*X3（其中对粘度影响不显著的参数因子X2氯化钠浓度已被剔除）。对该模型及回归系数进行显著性检验结果如表4。表4 粘度模型及各回归项系数的显著性检验项目模型常数项X1项X1*X1项X1*X2项P0.00010.02700.00090.00030.0002模型的P值为0.0001，达到极显著水平，表明回归方程可信。各影响因素项系数均达到极显著水平，表明回归方程系数可信。由回归方程可见，对复合体系粘度影响最显著的因素为pH，其次是温度，氯化钠浓度对复合体系粘度影响并不显著。2.2 KG对SPI乳化性的影响2.2.1 KG对SPI乳化性的影响在0.50%SPI中添加不同浓度的KG，体系乳化性能变化如表5。表5 KG对0.50%SPI乳化性能的影响KG添加量（%）00.010.030.050.100.150.200.250.30乳化值（）14.0251.2452.8454.5862.3867.6180.9285.2490.87标准误差0.1980.1120.1600.1250.2770.1621.1400.3750.545SPI分子链中分布着许多-N+H3、-COO-、-CON-H等亲水基团和许多脂肪烃基、芳香烃基、甲硫基等疏水基团6。这种特殊的结构决定了蛋白质分子的表面活性特征。但是由于SPI中主要为球状蛋白，常规条件下其在水中的溶解性并不好，分子中的许多基团特别是疏水基团并未能充分外露，因而在低浓度下，SPI表现出的乳化值很低，当SPI浓度为0.5%时乳化值仅为14.02%，基本不能满足实际生产上的需要。添加KG后，溶液乳化性能有着极显著的提高，随KG浓度增大，乳化性能不断增强。这可能是添加KG后，一方面由于KG与SPI发生作用，促进SPI球状分子的伸展，疏水基团不断暴露；另一方面由于KG在体系中的增稠作用，使伸展的SPI分子处于较为稳定的状态，从而大大提高了溶液的乳化性能。2.2.2不同增稠剂对SPI乳化性的影响分别以0.10%的KG溶液的粘度为准，测定出相近粘度的黄原胶XG、瓜尔豆胶GG浓度（见表6）。然后比较了3种增稠剂在相同浓度及相近粘度条件下对0.50%的SPI的乳化性能的影响，结果见图1。在相同浓度下，KG对SPI的乳化性能的提高程度皆大于黄原胶与瓜尔豆胶；而在相近粘度下，仍以KG对SPI的乳化性能提高最大，瓜尔豆胶与KG的影响相近，但此时瓜尔豆胶浓度已高达0.18%，而黄原胶虽然粘度高于KG，但对SPI乳化性能的提高仍明显小于KG。由此可见，KG对SPI乳化性的提高，不仅仅是由于KG的增稠作用，还因为两者分子之间发生了其它作用。表6 不同增稠剂的粘度表增稠剂KGXGGG浓度（%）0.100.100.120.100.18粘度（mPa.s）10.410.212.27.510.53.2.7多因素组合对复合体系乳化性能影响保持KG浓度0.05%、SPI浓度0.5%，研究pH、电解质、温度对该复合体系乳化性的影响，实验采用均匀设计表U12（1226）7。结果见表7。表7 多因素对复合体系乳化性能组合影响结果pHX1NaCl（mol/L）X2温度（）X3乳化值(%)标准误20.10704.7010.28519631.00503.4360.18027840.08906.1880.19087750.80603.0660.12592660.062545.4080.408570.60803.2570.3212580.045049.6740.78267890.40903.3530.034598100.027060.8240.615110.202554.1504.4545120.018095.4320.92130.156059.6060.9685运用SAS统计分析软件对实验结果进行回归分析，建立乳化值与各参试因子的回归模型：Y=-15.6088+8.6600X1+57.5861X2-19.6507X1*X2（其中对乳化值影响不显著的参数因子X3温度已被剔除）。对该模型及回归系数进行显著性检验结果如表8。表8 乳化值模型及各回归项系数的显著性检验项目模型常数项X1项X2项X1*X2项P0.00010.13740.00010.02750.0012模型的P值为0.0001，达到极显著水平，表明回归方程可信。各影响因素项系数均在0.05水平上差异显著，表明回归方程系数可信。由回归方程可见，对体系乳化值影响最显著的因素为氯化钠浓度，其次是pH，同时氯化钠浓度与pH对复合体系乳化值还存在交互作用影响，而温度则对复合体系乳化值无显著影响。2.3 KG与SPI的复合胶凝作用经预备实验，制备凝胶时选择氢氧化钙作为助凝剂，添加量0.10%。2.3.1 KG用量对复合凝胶性能的影响保持SPI浓度2.0%，添加不同浓度的KG，制备凝胶，凝胶性能测定结果如图2。随KG浓度的增加，凝胶强度明显呈上升趋势；而凝胶粘着性则先随KG浓度的增加而增强，当KG达到1.5%时，粘着性最强，随后则迅速下降。2.3.2 SPI用量对复合凝胶性能的影响保持KG用量1.5%，添加不同浓度的SPI制备凝胶。凝胶性能测定结果如图3。在08.0%范围内，随SPI浓度的增加，凝胶强度先缓缓上升，当SPI为2.0%时达最大值，此后随SPI增加，凝胶强度逐渐下降。这说明，KG与SPI之间存在一定的相互作用，当SPI达2.0%时，两者间达到最佳协同作用，随后添加的SPI在凝胶中逐渐起填充作用，减弱了KG-SPI之间的相互作用，因而凝胶强度下降。切开凝胶时发现随过量SPI的添加，凝胶内部已逐渐成为糊状。因而在随后的粘着性研究中，仅选用3.0%以下的SPI浓度来制备凝胶。在SPI为03.0%范围内，随SPI浓度增加，凝胶粘着性逐渐增强。与单独1.5%KG凝胶相比，1.5%KG-2.0%SPI复合凝胶的凝胶强度有所提高，粘着性明显增强。2.4 KG与SPI的作用机理研究2.4.1 氯化钠和脲对复合凝胶性能的影响保持KG浓度1.5%和SPI浓度2.0%，氢氧化钙用量0.10%，分别添加不同浓度的氯化钠和脲于复合体系，制备凝胶，测定凝胶强度的变化情况如图4和表9。表9 KG-SPI体系凝胶强度的损失率添加浓度（mol/L）凝胶强度的损失率（%）添加氯化钠添加脲0.21.4070.640.49.6281.510.6-6.3592.790.8-13.8696.021.0-19.1397.28随氯化钠浓度的增加，复合凝胶强度仅略有下降，当浓度达0.4mol/L以后，由于制得凝胶样品时已因氯化钠作用而部分脱水收缩，凝胶强度反而呈逐渐上升趋势。但随脲浓度的增加，凝胶强度则迅速下降。当添加浓度为0.2mol/L，凝胶强度已下降70.64%，而添加氯化钠时凝胶强度仅下降1.40%。当脲添加浓度达0.6 mol/L后，凝胶强度已很低，不易成型。凝胶强度的高低主要取决于形成凝胶网络的分子间相互作用的强弱，即分子间作用越强，凝胶强度越大；分子间作用越弱，凝胶强度越小。氯化钠的添加主要是削弱静电作用力，而对氢键作用无影响；脲的添加则会破坏氢键作用，但不会削弱静电作用8。氯化钠和脲对复合凝胶凝胶强度的影响结果表明：脲对凝胶体系中作用力的削弱作用极强，而氯化钠对凝胶体系中作用力的削弱作用很小，从而说明凝胶分子间相互作用主要为氢键作用。2.4.2 冷冻扫描电镜结构观察2.4.2.1 溶胶的显微结构观察图5为几种溶胶体系的冷冻扫描电镜照片。Kinsella9、Shen10等人的研究表明，蛋白溶胶的粘度主要与溶胶中蛋白的存在状态有关，在溶胶中蛋白胶粒尺寸越大，所占的空间越大，则粘度越大。由图5-a可见，在SPI溶胶中存在着高度聚集的蛋白质胶束和少量伸展的胶束，溶胶体系网络结构非常不均匀。该结果与单独SPI体系较低的粘度相一致。由图5-b可见，单独KG溶胶中KG胶束呈伸展的长链状分布，溶胶体系网络结构非常均匀。由图5-c可见，KG-SPI复合溶胶体系网络结构相对较为均匀，胶束呈伸展的链状分布，未见有明显聚集的胶束。从而可以推断由于KG的作用，使溶胶中SPI分散性更好。 图5 几种溶胶的扫描电镜图注：a、b、c样品分别为2.0%SPI溶胶、0.5% KG溶胶、0.5%KG-2.0%SPI复合溶胶2.4.2.2凝胶的扫描电镜照片图6为几种凝胶的冷冻扫描电镜照片。 图6 几种凝胶的扫描电镜图注：图中a、b、c、d样品分别为KG凝胶、KG-SPI复合凝胶、添加氯化钠的复合凝胶、添加脲的复合凝胶。由图6-a可见，单独KG凝胶体系形成完整、均匀和致密的三维网络结构，网络的支架细密，结合连贯。在图6-b中，KG-SPI复合凝胶凝胶网络结构不完整也不均匀，存在很多曲折、较粗的长链，这些大概为伸展的蛋白质链。图6-c为添加氯化钠的复合凝胶电镜照片，凝胶网络结构较为完整，但不够致密，略为松散，支架较粗，与前图相比，大概是由于高浓度氯化钠的添加，蛋白质链存在一定程度的卷曲收缩。这与添加0.6mol/L氯化钠后凝胶强度比未加氯化钠的复合凝胶强度强的结果相吻合。图6-d为添加脲后的复合凝胶电镜照片，凝胶结构粗糙，无规律性，网络结构不完整，均匀性差且松散。蛋白质与KGM分子发生严重的相分离，蛋白质分子间存在一定程度的聚集，而KGM链则较为松散，不能形成致密、均匀的凝胶网络，因而表现出的凝胶强度很低。2.5 红外光谱分析图7为几种溶胶的红外吸收光谱图。图7 几种溶胶的红外吸收光谱图注：图中a、b、c样品分别为KG溶胶、SPI溶胶液、KG-SPI复合溶胶中红外光谱大致可分为特征区和指纹区，特征区范围为40001500cm-1，有机分子常见的化学基团的特征振动频率主要在该区；指纹区范围为1500400cm-1，主要反映分子结构的细微变化11。由于KG与SPI本身皆为复杂的高分子混合物，通过红外光谱难以对其分子结构的细微变化进行分析，因而本研究仅对其特征区进行分析。图7-a中，3390.24cm-1处为OH的伸缩振动吸收，2888.84cm-1附近为CH的伸缩振动吸收，1725.98cm-1处为KG的乙酰基中C=O的伸缩振动特征吸收，1641.13cm-1处为半缩醛的伸缩振动吸收。图7-b中，3293.82cm-1附近的吸收带为OH和NH的伸缩振动吸收，由于两者的振动频率较近，图中没有分开，2877.272962.13cm-1处的吸收带为CH的伸缩振动吸收，1650.77cm-1处为酰胺键中C=O的伸缩振动吸收，1536.99cm-1处为NH的弯曲振动吸收。图7-c中，3288.04cm-1周围的吸收带为OH和NH的伸缩振动吸收，2931.27cm-1处为CH的伸缩振动，1725cm-1附近有一个弱的被掩盖的峰，应该为KGM的乙酰基中C=O的伸缩振动吸收，1644.98cm-1附近为半缩醛和酰胺键中C=O的伸缩振动吸收，1542.77cm-1处为NH的弯曲振动吸收。比较分析上述三组图谱，结果发现，在复合体系的红外光谱中并未出现不同于KG和SPI光谱的新的吸收峰，从而说明在复合体系中，KG与SPI分子上的功能性基团并没有发生本质上的改变，并无新的基团生成。根据图谱，仅发现形成复合溶胶后，OH和NH的吸收峰向低波段位移，分析原因是由于基团间通过氢键的缔合作用使得基团振动频率下降，因而推测KG与SPI复配后体系中氢键作用增强。3 讨论3.1 KG与SPI之间的作用机理蛋白质与多糖的相互作用可以分为3种类型：（1）共价键合；（2）静电作用、氢键作用、疏水作用等；（3）无交互作用12。根据SPI与KG复配后显著的协同增稠作用和溶胶的显微结构分析，KG对SPI乳化性能的明显提高，以及两者复配后形成凝胶的一些性能变化，可以推断KG与SPI之间存在着较强的交互作用。在胶体体系中蛋白质和多糖自发地形成复合物的可能性极小，一般需创造一定的条件13。红外光谱分析亦表明SPI与KG简单复配后并没有生成新的特征基团。而且共价键合的蛋白质与多糖聚合物能适应很广泛的溶液条件，如在广范围的pH值、离子强度范围内仍能保持良好的稳定性14，这亦与本实验结果不相符。因而共价作用并非KG与SPI间的主要作用。静电作用主要发生于分子中带有电荷的多糖与蛋白质之间，但KG为非离子型多糖，因而KG与SPI之间不可能存在强的静电作用。作为一种极强的亲水性多糖，KG分子中并没有强的疏水基团，因而KG与SPI之间也不会有强的疏水作用。氢键作用则主要发生于蛋白质与多糖分子链上羟基、氨基或胺基、羰基等基团之间，在KG与SPI这样的分子中极易发生。脲和氯化钠对复配凝胶凝胶强度的影响也证明复合凝胶中作用主要为氢键作用而非静电作用，再结合溶胶的红外光谱分析结果，可以推断SPI与KG之间的作用主要为氢键作用。3.2 KG与SPI复合作用的应用价值分析目前，KG与SPI作为食品原料及食品添加剂，在饮料、面制品、肉制品、调味品等食品的生产加工中皆已得到较广泛的应用。KG还可单独制作成保健的魔芋凝胶食品，但KG不易为人体所消化吸收，缺乏营养，因而显得美中不足。单独SPI在低浓度下乳化性、粘结性、胶凝性都较弱，若要满足实际生产的要求，则需很高浓度的添加量。将KG与SPI复配后，两者在部分性能上得到改善，如增稠性、乳化性粘着性、稳定性等，而在营养保健功能方面则又能优势互补，从而能够较好地满足实际生产的要求。如KG与SPI目前在肉制品中都有较大的应用，在使用时一般要求它们具有良好的乳化、粘结、胶凝作用；而在蛋白饮料制品中，一般要求蛋白质具有较好的溶解分散性和较强的乳化稳定性。KG与SPI复配后就可以满足这样的生产要求。此外，利用KG与SPI的复合胶凝作用，可以开发出新型的营养保健食品魔芋-大豆蛋白凝胶食品，该产品与单纯魔芋凝胶食品相比，营养保健功能得到加强，而且具有独特的品质。因而，KG与SPI的复配，在实际生产中将具有较高的实用价值和良好的应用前景。4 结论4.1魔芋胶与大豆分离蛋白之间具有显著的协同增稠作用；魔芋胶对大豆分离蛋白的乳化性能具有明显的改善作用；魔芋胶与大豆分离蛋白具有较好的复合胶凝作用。4.2魔芋胶与大豆分离蛋白复配后两者分子上的功能性基团没有发生本质上的改变，主要是通过分子间氢键发生作用。参考文献1.孙远明, 黄晓钰, 吴青等. 1999. 魔芋葡甘聚糖的结构、食品学性质及保健功能. 食品与发酵工业, 25(5): 47512. 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