研究生生化实验技术SOD-提取研究.doc

大豆SOD提取纯化分离及纯度、比活力测定生物化学与分子生物学专业硕士研究生生化技术实验指导教师：杨致芬，杨致荣，范月仙，潘登奎一、目的要求（1）掌握分段盐析沉淀分离蛋白质一般方法和技术要领；（2）掌握凝胶过滤前期准备与技术方法、基本原理和有关操作技术要领；（3）掌握SOD一般活性测定、PAGE法对酶活性鉴定技术方法；（4）掌握考马斯亮兰G250测定蛋白质方法；（5）掌握冷冻离心技术方法要领。二、实验材料及处理秤取20g大豆（晋豆5号）经表面消毒后，在蒸馏水中浸泡56小时（或晚上10点处理过夜）备用。三、试剂与仪器(1d)1.SephadexG-100，20-25g（2.5cm50cm层析柱/根干胶用量）2.0.05molL-1pH7.8磷酸缓冲液（提取液）；配置250ml，方法参见蒋立科主编现代生物化学实验技术p.307。3.1mmolL-1 pH7.0磷酸缓冲液（洗脱液）；配置20003000ml，方法同上第2。4酶活性测定反应液：参考高继国，郭春绒主编现代生物化学实验P.108112。0.05mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.8）；秤取0.9700g甲硫氨酸用0.05mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.8）溶解定溶至50ml即为130mmolL-1 。0.05mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.8）配置750mmolL-1NBT（氮兰四唑）：秤取32mgNBT用0.05mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.8）溶解定溶至50ml，装棕色瓶低温（04）保存。20mmolL-1核黄素：秤取0.00753g核黄素用水定溶至1000ml。100mmolL-1的EDTANa2溶液：秤取0.037g用溶0.05mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.8）解定溶至100ml，从中取出10ml再用0.05mmolL-1磷酸缓冲液（pH7.8）定溶至100ml。5氯仿：乙醇（23v/v）混合液；6(NH4)2SO4固体粉末（用研钵充分研磨秤粉末，颗粒越细越好）；7K2HPO4（研钵充分研磨成粉末，颗粒越细越好）；8所需要仪器设备消耗材料自动部分收集器1台；层析柱2.860cm 1根；250ml三角瓶2个；500ml烧杯3个；10cm长度滴管2个；电子天平1台；抽滤装置；高速冷冻离心机1台（国产，湘仪产）；蠕动泵2个；核酸蛋白检测仪2台；纪录仪2台；配电盘2个；真空泵1个；真空干燥器1个；100度恒温水浴器1个；直径2cm乳胶管1米；1K滤纸5张。*注意事项：所有试剂及储备液均使用DW配置；所有容器、量具、玻棒等度必须用去污粉洗涤，双重蒸水冲洗一次以上；配置mmol级浓度溶液时，一定要用1/10000杆量电子天平秤量，决不可以台秤代之；而%浓度或mol级浓度配置时可用台秤秤量； 配置试剂中，需要低温保存的一定要低温保存；该用棕色瓶装的也决不使用白色瓶装；该临时配置的溶液，做试验过程中出时间安排好进行配置，决不可因为配置试剂而窝工。四、实验操作(1d)1.凝胶处理：根据葡聚糖凝胶材料瓶外包装上的技术参数和层析柱容积计算凝胶用量秤取凝胶放入500ml锥形三角瓶中加入约350ml重蒸水沸水浴5小时冷至室温准备装柱。*注意事项：参考现代生物化学实验技术P.117118。2装柱将处理好的凝胶悬浮液轻轻晃动倾出上层细小颗粒上层液（依据实际情况反复3-5次）真空排气30min一次性连续倾入层析柱中让其自然沉降，装胶高约50cm左右高（注意千万不要加入气泡，且不能分层或出现不均匀现象）用0.05molL-1pH7.0磷酸缓冲液平衡（约300ml）加入床面保护滤纸(亦可在胶面上加1cm处理好的凝胶SephadexG-25)上样。*注意事项：参考蒋立科，杨婉身主编现代生物化学实验技术P.111112。3.上样（上样要求祥见后面操作用）：上样后用1mmolL-1磷酸缓冲液洗脱30min（洗脱速度为1ml/min）A280nm开始检测、记录、分部收集用SOD活性测定方法检测洗脱峰对应管中SOD活性（在洗脱曲线中描出活性曲线）。*注意事项：参考蒋立科，杨婉身主编现代生物化学实验技术P.113114。4.测定上样样品SOD活性和蛋白质含量，同时测定具有SOD活性管中蛋白质含量，求出比活力及比活力提高倍数。*注意事项：测定方法详见参考文献或注释。5.根据SDS-PAGE结果中谱带数目鉴定SOD纯度（专业生物化学研究生完成，非生化专业研究生舍去此项实验）。五、粗酶液制备、分段盐析、层析脱盐和分离1秤取10g浸泡处理好的大豆加入2030ml、0.05molL-1（pH7.8）的磷酸缓冲液冰浴上进行充分匀浆（尽可能使亚细胞中的SOD亦能够释放出来）10000g冷冻（04）离心15min上清液为SOD酶的粗提液取15ml酶粗提液置小烧杯于冰浴上逐步（滴）加入0.25体积的氯仿-乙醇（2:3V/V）处理20min，其间要求在磁力搅拌器上于冰浴上连续搅动（缓慢加入并不断搅动，以免产生泡沫而使SOD失活；此步骤主要是去除油脂、脂溶性蛋白和进一步破碎亚细胞）10000g离心15min上清液在冰浴上逐步加入K2HPO4粉末（每10ml加入0.2g，在0下不断搅动溶液的条件下慢慢逐步加入，千万不可一下子加入K2HPO4，否则会由于局部过饱和而使得部分SOD同时沉淀丢失和避免杂蛋白共沉淀混入SOD蛋白中）10000g冷冻离心15min弃去沉淀，上清液用030%(NH4)2SO4沉淀（04，不断搅动条件下慢慢加入硫酸铵，主要是避免局部过饱和而使SOD沉淀而丢失）10000g15min弃去沉淀，上清液用3060%(NH4)2SO4沉淀（04，不断搅动条件下慢慢加入硫酸铵，以避免(NH4)2SO4局部过饱和而使杂蛋白同时沉淀）10000g15min收集沉淀沉淀用04预冷的1mmolL-1磷酸缓冲液溶解（大致按照4ml5ml/g加入溶液该溶液）取3ml5ml为上样液SephadexG-100(Sigma)柱（2.860cm或2.890cm）层析用用04预冷的1mmolL-1磷酸缓冲液进行洗脱，每管收集2ml洗脱液根据洗脱峰寻找对应的试管尽快检查出具有最高SOD活性的试管将SOD活性最高试管溶液按照0.5ml/管分装编号标记试管04条件下保存一份，另一份保存在-30备用考马斯亮兰G-250染料法测定蛋白质含量和SDS-PAGE法鉴定SOD纯度（此过程中仍然继续洗脱，30分钟后可再次上样进行层析，以保证得到足够的SOD来满足相继实验之需）。2层析过程和层析完毕后SephadexG-100凝胶处理。*注意事项：层析操作过程出现问题的处理方法，参考蒋立科，杨婉身主编现代生物化学实验技术P.114 第9.重新装柱和P.114116。六、蛋白质测定参考线粒体膜标记酶测定1考马斯亮兰G-250染料法测定蛋白质含量及工作曲线制作参考高继国，郭春绒老师主编实验指导P.44-46。2为了在较短时间内完成，建议几个人可分头进行工作。七、大豆SOD活性测定方法(1d)基本上按照Giannoptis和Ries（1977）方法，利用SOD抑制氮兰四唑（NBT）在荧光下的还原作用。*注意事项：建议在层析分离过程中，应该准备好SOD活性测定实验药品或试剂。以确保在酶失活之前测定完毕。方法参见高继国，郭春绒老师主编实验指导P.108-112主编。八、大豆SOD SDS-PAGE纯度鉴定(1d)将纯化得到的SOD溶液适当浓缩：取纯化液0.30.5ml置于1.5mlEppendorff管中加入4倍体积的冷丙酮（-30过夜）10000g离心20min弃去上清液沉淀加入300ml或500mLSDS-PAGE方法中所用的提取液（按照2030mL/mg沉淀加入）。九、实验报告要求：1实验准备工作：试剂浓度配置量设计、计算、配置方法、凝胶回收或长期保存方法；2所用仪器清单（包括型号、规格、大小、数量）；3写清实验目的、原理、较详细的操作步骤和注意事项； 4实验结果分析：分子筛层析纪录仪结果分析；SOD活性原始数据、活性计算及蛋白含量测定原始数据与比活力计算结果；纯化SOD的SDS-PAGE纯度鉴定图谱及分析结果；实验过程中出现特殊现象产生的原因及处理方法。计算完成下表纯化步骤Purification step总体积(ml)Total volume总蛋白(mg)Total protein总活力(酶单位)Total activity比活力Specific activity回收率%Yield纯化倍数Purification(fold)粗提液Crude extract氯仿-乙醇Chloroform-echanol(NH4)2SO4(30-60%)SephadexG-100十、其它参考文献：1王爱国，罗广华，邵从本，等.大豆超氧岐化酶的研究，J.植物生理学报,1983,9(1):77.十一、思考题：1SephadexG-100凝胶装柱前溶涨处理一般方法有哪几种，其主要优缺点。2SephadexG-100凝胶柱层析分离蛋白质原理。3SOD粗提液用0.25体积的氯仿乙醇（23V/V）处理20分钟，10000g离心15min，其主要目的何在？其过程中为什么要求处理20min？此处的“处理”具体是指何种操作？4脱脂后的上清液每10ml加入0.2gK2HPO4处理，并离心，保留上清液。这一步操作目的何在？5030%和3060%(NH4)2SO4分部沉淀的作用或目的何在？6SOD活性测定方法常见的有哪几种？主要原理如何？7PAGE分离蛋白质基本原理中的三种效应分别是指什么？如何解释三效应？8假如现有50ml酶蛋白溶液，需要25%(NH4)2SO4沉淀去除杂蛋白，离心沉淀后应