分子生物学习题.doc

1. 列举主要的几种基因诊断技术及其应用.1）PCR技术:HBV DNA的定量检测2）支链DNA技术：定量检测待测核酸含量3）DNA杂交技术：检测HBV基因型和耐药突变4）基因芯片技术：鉴定HBV基因型，检测感染情况，病毒种类及亚型，病毒的耐受情况5）DNA测序：检测多位点突变2. 感染性疾病的基因诊断策略.一般性检出策略：即只需要提供是否有某种病原体的感染完整检出策略：即不仅对病原体做出诊断，还要进行分型和耐药性方面的检测3. 基因治疗的病毒载体主要有哪几种？各有怎样的特点？逆转录病毒载体的特点；（1）结构和感染过程与普通逆转录病毒相似；（2）可使靶细胞变成稳定表达目的基因的转化细胞；（3）感染靶细胞后不扩散；（4）假病毒感染靶细胞的效率非常高；（5）不感染非增殖细胞。病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒载体、疱疹病毒载体等 腺病毒载体特点（1）宿主范围广（2）腺病毒蛋白表达不以宿主增殖为必要条件（3）可获得高病毒效价（4）重组体非常稳定（5）不会引起肿瘤（6）有较高的安全性（7）无包膜，不易被补体灭活，可直接在体内应用（8）不整合入染色体疱疹病毒载体特点（1）滴度高（2）容量大（3）增殖细胞和非增殖细胞均可感染（4）不整合，但可长期存在并可稳定表达腺相关病毒：1)生物安全性高2）宿主范围广泛3）可以介导长期的基因表达4）适合在活体条件下将基因转入特定的靶细胞内，同时又不诱发机体对被感染细胞产生免疫反应。慢病毒载体:高效感染宿主细胞，并且其感染范围广；能逃避人体免疫系统的监视，从而防止免疫排斥 ,4. 查阅相关文献，说明基因治疗在SCID中的应用 严重联合免疫缺陷（severe combined immune deficiency）1991年，美国向一患先天性免疫缺陷病（遗传性腺苷脱氨酶ADA基因缺陷）的女孩体内导入重组的ADA基因，获得成功研究者曾报道，对2名X染色体连锁遗传重症联合免疫缺陷(SCID)患儿应用基因治疗可恢复其免疫系统功能。SCID又称“空泡男孩综合征”，如不治疗，患儿必需在无菌环境中生活，一般的感染对其都可能是致命的。约半数SCID由X染色体缺陷所致。男孩的X染色体遗传自母亲，故此型SCID均为男性患病。该遗传缺陷影响成熟T细胞和自然杀伤细胞的发育，而这两者是机体对外来病毒和细菌等入侵者的主要防护者。迄今为止，法国巴黎Necker Enfants Malades医院的Marina Cavazzana-Calvo博士及其同事已成功治疗了4例(4/5)SCID患儿。他们去除患儿骨髓，修复未成熟免疫细胞的遗传缺陷，然后将修正的细胞再输入患儿体内。不足4个月，4名患儿体内即出现了成熟T细胞和自然杀伤细胞，治疗2年多后其T细胞反应仍接近正常。研究者在4月18日出版的新英格兰医学杂志上撰文指出，免疫缺陷的修正可使患儿对感染产生抵抗力，从而过上正常生活。治疗时间选择在1-11个月龄，最初两名患儿随访2.5年，另两名患儿分别随访1.5年和2年。在相关述评中，波士顿血液研究中心的Fred S. Rosen博士指出，近年来许多SCID患儿通过移植供者骨髓细胞获得治愈。骨髓可生成构成免疫系统的血细胞，故移植健康骨髓可治疗SCID，但寻找适宜的骨髓捐献者非常困难。此外，骨髓移植提供的T细胞数量有限，且不能修复B细胞。该研究提示基因治疗可产生正常数量的工作T细胞和足够的B细胞，且效果优于骨髓移植。Cavazzana-Calvo博士认为基因治疗可用于无适宜供体骨髓的X染色体连锁SCID患儿生物分子的分离纯化聚合酶链反应一、名解荧光光度法: 核酸在荧光染料溴化乙锭（EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。 酚抽提法: SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，去壁细菌再用SDS裂解，从而温和地释放质粒DNA到等渗液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA .由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。碱裂解法：在NaOH提供的高pH（12.012.6）条件下，用强阴离子去垢剂SDS破坏细胞壁，裂解细胞，与NaOH共同使宿主细胞的蛋白质与染色体DNA发生变性，释放出质粒DNA。 比活：specific activity单位蛋白质重量中的生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示）， 凝胶过滤层析：凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。巢式PCR: nested PCR,即用两对引物，一对引物序列在模板的外侧，另一对引物序列在模板内侧。第一对引物做PCR的扩增产物作为第二对引物退火的模板，再做PCR。灵敏度和特异性都得到大的提高。 荧光定量PCR：Fluorescence quantitive polymerase chain reaction,FQ-PCR,基于荧光能量传递技术，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，转移效率与两个发色团之间距离6次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光信号便可得知靶序列初始浓度。 Ct值: 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。二、问答1、根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。2、分离纯化过程中，如何保持核酸的完整性？1）温度不要过高(04)；(高温破坏氢键) 2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键) 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.3、什么原因易引起DNA降解，该如何解决？原因：1）材料不新鲜或反复冻融2）未很好抑制内源核酸酶的活性3）提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4）外源核酸酶污染5）反复冻融解决：1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2）液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融4、在蛋白质分离纯化过程中应注意哪些因素？1）缓冲液 2）盐、金属离子和螯合剂.3）还原剂 4）去垢剂5） 增溶剂 6） 蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor）7） 蛋白质的环境因素 表面效应的影响温度的影响储存5. 简述PCR技术的基本原理.PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。6. PCR实验中，假阴性现象如何排除？可以归纳以下几方面原因:1)标本处理的原因。 处理标本时，靶DNA丢失。 处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2)PCR试剂问题。 引物设计不合理。 Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR扩增过程中的问PCR扩增仪故障。PCR扩增反应液没有加液体石蜡油 4) PCR产物鉴定中的问题 电泳时没有加溴化乙锭。 电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。凝胶浓度过低，使扩增带跑散。7.在PCR过程中应注意哪些事项？反应体系： （五要素）（1）、模板：一般100ng DNA模板/100mL。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加；PCR对模板的要求不高，但反应体系一般不含有影响DNA聚合酶活性的杂质。一般模板加入量为102105拷贝的靶序列较为合适。（2）、引物：、浓度：一般为0.1-0.5mmol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降；、长度：一般为15-30个核苷酸，最多不超过50个；、碱基分布的均衡性：G-C含量一般为4060，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应；、溶解温度（Tm值）：一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度；、引物自身：3端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构，5端序列对PCR影响不如3端大，常用来引进修饰位点或标记物；（3）、DNA聚合酶：一般为0.5-5 U/100 ml，酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量；（4）、dNTP：浓度取决于扩增片段的长度，四种dNTP浓度应相等，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；（5）PCR缓冲液：KCL浓度过高会抑制T