开题报告 两种植物抗逆基因挖掘与功能分析.doc

研究生论文开题报告题目 两种植物抗逆基因挖掘与功能分析 姓 名： 杨 涛 学 号： 201030211010 入学时间： 2010-9 所在学院： 植物科学技术学院 学科专业（类别及领域）： 作物遗传与育种 研究方向： 作物分子育种与利用 指导教师： 赵 昌 平 报告主持人: 王 宏 芝 报告时间： 2010-11-9 北京农学院研究生部制 年 月 日填 表 说 明一、 开题报告各项内容要实事求是，逐条认真填写，表达要明确、严谨。二、 开题报告需用计算机打印，一律A4纸双面打印，于左侧装订成册。三、 论文开题报告的一级标题1，二级标题1.1，三级标题1.1.1，四级标题，标题字体均为小四号黑体加粗;开题报告内容字体为五号宋体,行距为1倍行距；参考文献字体为小五号宋体。四、此表填写一式四份，一份交所在学院留存（含电子版），一份交指导教师，一份学生自存，一份交研究生部留存（含电子版）。联系电-MAIL18701673554163.com入学时间 2010-9论文题目两种植物抗逆基因挖掘与功能分析课题来源课题性质一立论依据1、前言植物育种就是人们按照自己的意愿，有目的、有计划地获得人们所需要的植物新品种的过程。主要包括两种情况： (1)从不良性状中把所需要的优良性状（相对性状）分离出来或把位于不同个体的优良性状集中到一个个体上来。 (2)创造具有优良性状的生物新品种。作物育种包括引种、常规系统育种、杂交育种、分子育种及其他育种等多种方法。利用杂种优势的杂交育种方法显著提高了农作物产量，保障了世界粮食安全。上世纪80年代我国各种作物育种几乎都还靠外引品种来更新品种，90年代初以后靠自育品种，其中杂交育种方法为我国水稻、玉米、棉花、油菜等作物育种事业做出了巨大贡献。随着生物技术的发展，分子育种弥补了杂交育种等常规方法纯化速度慢、育种周期长等缺点。转基因育种是分子生物育种的有效途径，加快了作物育种进程、提高作物产量、改善品质和增强抗逆性。然而，转基因育种经过多年的发展虽然育成了上千种作物新品种，但在作物分子生物育种方面，基本没有广适应性、性状稳定能特大面积推广的品种。其根本原因就是缺乏优良的抗逆基因资源。2、抗逆相关蛋白激酶基因研究进展随着后基因组时代的到来，人们越来越认识到生命活动不仅仅关系基因，更与基因翻译后蛋白及蛋白互作密切相关；对生命科学的研究也开始倾向于系统研究。在一系列研究成果和重大发现之后，目前有关植物调控逆境胁迫和生长发育的研究重点逐渐从功能基因转到蛋白激酶等调控基因的鉴定、功能分析及其调控机理等方面。蛋白激酶是一类能够使其它蛋白质磷酸化的酶，其在植物体内是信号传递的重要载体，它们通过催化功能蛋白的磷酸化，导致其构象发生改变，从而调节植物的生长、发育、自交不亲和、雄性不育、抗逆和抗病等多种生理过程；在植物中几乎参与植物生命周期中一切生理调节过程。目前研究表明，蛋白激酶基因约占植物结构基因的1%-3%。以底物蛋白被磷酸化的不同位点对蛋白激酶进行分类可分为5类：（1）丝/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶；（2）酪氨酸（Tyr）蛋白激酶；（3）组氨酸（His）蛋白激酶；（4）色氨酸（Try）蛋白激酶；（5）天冬氨酰基/谷氨酰基（Asp/Glu）蛋白激酶。目前植物中发现的蛋白激酶以前 3 类为主，尤其以丝/苏氨酸类蛋白激酶居多。而根据催化区氨基酸序列的相似性，又可将其分为5大组：AGC组、CaMK组、CMGC组、PTK组和其它组。2.1蛋白激酶的结构 迄今为止发现的所有蛋白激酶其作用方式和功能多种多样，然而在它们的催化区域都具有相似的氨基酸序列。通过对蛋白激酶氨基酸序列的保守性分析发现，催化功能域由大约 250300个氨基酸残基构成，包括 12个亚区（如图1所示）。不同类型蛋白激酶的区别主要集中在、亚域，例如：第区丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的保守序列为：Asp-Leu-Lys-Pro-Glu-Asn，而酪氨酸蛋白激酶的保守序列则为：Asp-Leu-Arg-Ala-Asn 或Asp-Leu-Ala-Ala-Arg-Asn。2.2 SnRK蛋白激酶家族蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不同，被分为三个亚家族分别是：SnRK1，SnRK2和SnRK3 （见图1）。SnRK1是糖信号传导过程中的关键因子，在植物中控制糖和淀粉的代谢，SnRK2和SnRK3亚家图1 蛋白激酶SnRK家族成员结构简图族由于调节区在C-末端的高度分散，推测它们的功能是蛋白间的相互作用或是调节激酶的活性。SnRK2主要受渗透胁迫和ABA信号诱导。SnRK3又被称为类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶（Calcineurin B-like Calcium Sensor-Interacting Protein Kinases, CIPK），它们与类钙调磷酸酶B亚基相互作用，形成网络介导Ca2+信号的传导和一系列复杂的外界刺激。近年来，对高等植物SnRK2基因家族和SnRK3基因家族的研究报道较多。蚕豆AAPK和拟南芥OST1/SRK2E都是SnRK2家族的基因，已经证实被ABA激活，在ABA控制气孔关闭过程及相关基因的表达过程中起着一定的作用。小麦SnRK2家族基因TaSnRK2.7在糖代谢、降低渗透势、增强光系统II的活性以及促进植物生根等生理生化过程中起着重要作用。水稻SnRK2家族基因OsSAPK 4的诱导表达可以提高水稻在盐胁迫下种子的萌发率。拟南芥SnRK2.6基因通过参与调控主要的逆境胁迫代谢过程和ABA信号途径来控制气孔的开度。水稻SnRK3家族基因CIPK1受冷、光、盐等多种胁迫诱导。上述研究表明，SnRK家族基因受胁迫诱导表达，在抵抗逆境胁迫过程中起着重要的作用。3、抗逆相关RNA结合蛋白基因研究进展真核生物基因表达是一个被高度调控的过程，其主要涉及到三方面：转录、转录后及翻译后。基因表达调控首先就是在转录水平，主要是一些转录因子参与调节在各种内外环境刺激下特定基因RNA的合成。另外，就是在蛋白质水平的翻译后调控，如激酶磷酸化、泛素连接酶等被公认为能在时空上控制细胞内功能蛋白的产生。然而，对于介于上述两方面之间的转录后调控的认识还特别少。近几年，通过研究低等真核生物如酵母、克氏锥虫等越来越多的发现表明：转录后调控RNA的作用因子为一系列RNA结合蛋白（RNA-Binging Proteins ,RBPs）。并且， Gygi SP等、Washburn MP等通过研究酵母分别在1999年、2003年都发表文章阐明转录的mRNA数量与基因的蛋白质数量之间只有很微弱的相关性。 Noe G等研究表明克氏锥虫基因表达主要通过RBPs来进行转录后水平调控。RBPs在mRNA存在的各个主要环节中都发挥着重要作用，如mRNA的拼接、转运、定位、翻译及退化等（如下图2所示）。在细胞核内RBP结合在mRNA前体（Pre-mRNA）上调节促进内含子的剪切及拼接形成成熟的mRNA；RBP还能调节成熟mRNA从细胞核转运到细胞质；RBP能调节mRNA识别定位目标，如mRNA识别定位线粒体；RBP还参与调控mRNA的稳定性，调节mRNA图2 RBPs参与mRNA各环节调控的退化；在调控mRNA的翻译过程中RBP也发挥重要作用。在这些复杂过程中RNA结合蛋白通过与RNA相互作用形成核糖核蛋白复合体 (Ribonucleoprotein Complex)，直接或间接地参与了这些过程。RNA结合蛋白种类很多，估计占细胞编码蛋白的6-8%，但迄今为止只有为数不多的几种RBP，如HuR、AUF1、TTP、T1A1及CUGBP2等被证实可特异参与mRNA拼接、稳定性、翻译和其他层面的基因调控。 在各种生物细胞中, RNA 结合蛋白包括异源核糖核蛋白( Heterogeneous ribonucleoproteins)、小核糖核蛋白( Small Nuclear ribonucleoproteins)、Poly( A) 结合蛋白、叶绿体 RNA结合蛋白、植物富含甘氨酸RNA结合蛋白( Glycine-rich RNA-binding Proteins, GRPs)、哺乳动物富含甘氨酸RNA结合蛋白和蓝细菌RNA结合蛋白等。众多的RNA结合蛋白氨基酸序列有一定的同源性，目前已经发现了许多 RNA 结合结构域( RNA-binding domain, RBD)，包括: RNA识别模体( RNA Recognition Motif, RRM)、KH结构域、锌指结构( Zinc finger)、RGG box、DEAD/DEAH box、Pumilio/FBF( PUF)、双链RNA结构域（double-stranded RNA binding domain）、富含精氨酸模体（Arginine-rich motif）、Piwi/Argonaute/Zwille( PAZ) domain、Sm-protein模体。这些结构域各自具有特定的保守序列及不同的功能。很多RNA 结合蛋白含有1个或者更多的相同结构域的拷贝, 而其它一些RNA结合蛋白含有2个或者更多的不同结构域。在高等植物中，Wilkinson, MF等发现铁敏感RNA结合蛋白能调节mRNA的翻译和降解；陈丹生等发现叶绿体多聚腺苷酸结合蛋白( cPABP) RB47 特异性地与 PsbA mRNA 的 5 UTR 结合, 并对于该 mRNA 的翻译起重要作用；景润春等实验发现RRM RNA 结合蛋白基因家族参与了细胞核与细胞质的相互作用，同时, 细胞质雄性不育性的形成与育性恢复均与细胞质内线粒体基因组变异与转录后调控有关；董霞等研究表明富含甘氨酸的RNA结合蛋白GRPs 基因可作为烟草水杨酸代谢途径中的一个标记基因研究其途径对逆境的应答。转录后调控过程涉及的众多蛋白质中最重要的一类是含RNA识别基序(RNA recognition motif , RRM)的RNA 结合蛋白。RRM 通常由8090个氨基酸组成, 其中含有8个氨基酸和6个氨基酸组成的RNP1和RNP2 两个结合RNA所必需的高度保守的亚基序。富含甘氨酸RNA结合蛋白(GRRBPs)是植物中丰度较高的蛋白, 它是一类氨基端有1个RRM 结构域, 而羧基端具可变长度的富含甘氨酸结构域的蛋白。植物中该基因最早在玉米中被克隆，随后相继在拟南芥、烟草、大麦等多种植物中被克隆得到。研究表明, 这种蛋白参与了植物对多种逆境条件的反应调节,如冷害、干旱、水涝、伤害、盐压、外源脱落酸 (AB A )或水杨酸( SA)处理等。在众多植物中研究较多、较深入的是拟南芥的GRBPs。遗传学和生理学方面的数据提供了清楚的证据表明GRRBPs在植物抗逆反应中起重要作用。研究表明拟南芥中的GRRBP 1、GRRBP2、GRRBP3、GRRBP4、GRRBP7、GRRBP8基因表达量在低温条件下显著增加。干旱、盐分压力也会引起GRRBP1、GRRBP4和GRRBP7转录产物不同程度地增加。与低温条件下GRRBP2表达量增加相对应,拟南芥GRRBP2突变株低温条件下与野生型相比表现出发芽、幼苗生长延迟的现象；而过量表达GRRBP 2植株发芽时间提早，幼苗生长更好, 而且对冻害表现出更强的耐受力。4、研究的目的与意义 4.1研究目的本研究拟采用小陕北小麦地方品种和尚头、北京市农林科学院杂交小麦工程技术研究中心选育的光温敏不育系材料Bs366、前苏联长穗偃麦草和高粱等作为试验材料，采用同源克隆与蛋白质组学的方法旨在挖掘到一批SnRK抗逆蛋白激酶家族基因和抗逆相关RNA结合蛋白基因，为小麦转基因育种提供广适、有效的抗逆基因资源。 4.2研究意义小麦籽粒蛋白含量及蛋白质与淀粉之比最适合人体需要，全世界大约1/3的人口主要靠小麦为生。全世界约有103个国家种植小麦，是播种面积最大的谷类作物。因此，小麦在世界粮食安全中占有举足轻重的位置。在农业生物技术中，无论与细胞工程中的花药培养技术离体组织诱变胚珠和幼胚培养，还是与染色体工程中的原生质体培养胚胎工程相比，转基因技术的研究和开发是最具现实意义的一个优先领域，也是产业化最成功的一项生物技术。但是，从转基因研究开始至今存在一个很突出的问题就是，广适应性的优良抗逆基因资源匮乏。因此，克隆新的抗逆蛋白激酶基因、抗逆相干RNA结合蛋白基因，及通过对这些基因进行序列分析、亚细胞定位研究、表达性研究以及转基因拟南芥、烟草逆境胁迫下的表型研究以明确其生理生化特点和功能，从而深入解析植物中抗逆相关基因功能，同时为作物抗逆分子育种的应用奠定理论和实践基础；为小麦抗逆分子育种提供丰富的抗逆基因资源。参考文献1 Boudsocq M, Laurire C. 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