第21章 细胞周期及其调控

第21章细胞周期及其调控CellCycle&Regulatin,.,第一节细胞周期各时项的动态变化,一、细胞周期概念细胞周期（cellcycle）：*是指细胞从上一次分裂结束开始生长，到下一次细胞分裂结束所经历的过程，又称细胞增殖周期。细胞周期时间（TC）:细胞周期经历的时间。,.,细胞周期,间期,分裂期（M期）,DNA合成前期（G1期,G1gap1）,DNA合成期（S期,Synthsisphase）,DNA合成后期（G2期,G2gap2）,前期,中期,后期,末期,细胞周期中的细胞,细胞周期分为*：G1期、S期、G2期和M期四个时期。,(Mitosis,division）,细胞类型（增殖特性）*周期性细胞：始终保持旺盛的增殖活性。G0期细胞：一般不分裂，暂不增殖细胞。终端分化细胞（无增殖能力细胞）结构和功能高度特化。,周期性细胞,终端分化细胞,.,研究方法：流式细胞术细胞同步化生化方法等等,（一）G1期（DNA合成前期）的生物学事件*G1早期：细胞体积增大、生物合成、形成细胞器触发蛋白、钙调蛋白增加。体积、表面积、核质比G1晚期：H1及多种蛋白激酶磷酸化，为DNA合成准备。信号分子调控G0G1晚S期startpoint（DNA合成相关酶，细胞周期运行的蛋白）,（二）S期（DNA合成期）1.DNA复制多种酶的参与。2.蛋白质合成：（组蛋白、非组蛋白）组装核小体。3.中心粒的复制，并发生分离，发挥微管的组织作用。,（三）G2期（有丝分裂前期）的生物学事件*1.促有丝分裂因子(MPF)合成2.微管蛋白（tubulin)合成3.0.3%DNA复制4.结构功能蛋白的合成G2期checkpoint：1.是否完成DNA复制？2.是否有DNA错误复制？,.,有丝分裂的主要特征是：姊妹染色单体分离；核膜、核仁破裂重建。人为的划分为四个时期：前期、中期、后期、末期。,（四）M期（有丝分裂期）,.,细胞有丝分裂过程,.,1.有丝分裂间期,核膜,核仁,染色质,中心粒,.,1.前期染色质凝缩，分裂极确立与纺锤体开始形成，核仁解体，核膜消失。,前期,.,.,星体微管：由中心体向外放射，末端结合有分子马达，负责两极的分离,动粒微管：由中心体发出，连接在染色体着丝点动粒上,着丝点上具有马达蛋白。,极体微管：由中心体发出，在纺锤体中部重叠，重叠部位结合有分子马达，负责将两极推开,-,-,+,+,+,+,+,纺锤体有三种微管结构：,.,染色体的运动,.,Twocentrosomes,andtheirformingradialarraysofastralmicrotubulesseparatingonthesurfaceofanearlyprophasenewtlungcellnucleus.,.,2.中期染色体排列到在细胞的赤道面上。,赤道板,中期,.,3.后期姐妹染色体单体分离并移向细胞两极。,后期,.,该阶段染色体的分离由微管去聚合假说解释：动粒微管不断解聚缩短,造成的拉力将染色体拉向两极。,机理：微管正端插入动粒的外层,微管在此端去组装。动粒中的ATP水解,提供能量,驱动微管上的马达分子向极部移动,拉动染色体向极移动。,.,4.末期从子染色体到达两极，至形成两个新细胞的时期。两个出现：核膜出现、核仁出现两个消失：染色体消失、纺锤丝消失,中间小体,.,从子染色体到达两极，至形成两个新细胞的时期。主要标志是子核的形成和胞质分裂。,中间小体,.,动物细胞的胞质分裂通过胞质收缩环的收缩实现，收缩环由大量平行排列的肌动蛋白组成。用细胞松弛素处理这一时期的细胞，会出现什么现象？,.,.,.,DividingMuscleMyoblast(primativemusclecell),(SEMx8,000),.,第二节细胞周期调控的动力因素,一、细胞周期调控蛋白(cellcycle-regulatingprotein),CDK类蛋白激酶催化亚单位细胞周期素（Cyclin)调节亚单位CDK抑制因子（CKI）抑制CDK激酶活性,M期促发因子(MPF),MPF的发现：一种在G2期形成，能促进M期启动的调控因子，即促细胞成熟因子或促细胞分裂因子（MPF)。,（一）细胞周期调控研究过程的重要事件：,.,（二）细胞周期调控蛋白的种类,1.CDK类蛋白激酶（cyclin-dependentkinase）：CDK与细胞周期素结合才具有激酶的活性，故称细胞周期素依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)作用：CDK可将特定蛋白磷酸化，促进细胞周期运行。在动物中已知7种CDK，CDK1-7。分为四类：G1、G1/S、S期CDK和M期CDK。,.,2.细胞周期素（cyclins)*是一类随细胞周期的变化呈现周期性出现和消失的蛋白质。（含A、B、C、D、E、H，20多种亚型）表达在时间不同，执行功能也多种多样。特点：在细胞周期中呈周期性变化。作用：能与CDK结合，激活CDK，间接调节细胞周期运行。,.,DEAB,在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分为4类：G1型、G1/S型、S型、M型。G1、G1/S、G2期(CyclinD、E、A)M期(CyclinB),不同类型CDK-Cyclin复合物,*包括D1-3，各亚型cyclinD在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,.,3.细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDKinhibitor,CKI）,CDKI是对CDK激酶起负性调控作用的蛋白质。已发现多种CDKIINK4家族:p16、p15、p18、p19抑制CDK4CIP/KIP家族:P21、P27、P57在G1期抑制多种CDK,CKI对细胞周期起负调控作用，分为：Ink4:P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d，特异性抑制cdk4-cyclinD1,cdk6-cyclinD1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多数CDK的激酶活性。P21cip1还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。,.,A,E,D,P16,P18,P15,P27,P21,CDK4/6,CDK2,CDK2,TGF-,血清缺乏,分化,DNA损伤,P53,.,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。结合M-cyclin的CDK1被Wee1（抑制因子）将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。在M期，Wee1（一种细胞周期调节蛋白）活性下降，CDC25磷酸酶使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CAK)的作用下完成的。,（三）M期CDK的激活,.,.,分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destructionbox)。当MPF活性达到最高时，通过泛素连接酶催化泛素与cyclin结合，cyclin随之被26S蛋白酶体水解。G1周期蛋白也通过类似的途径降解，但其N端没有降解盒，C端有一段PEST序列与其降解有关。,3.M期周期蛋白与分裂中期向后期转化,.,泛素的概念：*由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径，泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。,.,细胞周期蛋白降解盒与降解途径,.,泛素介导的周期蛋白降解,.,细胞周期中CyclinB的合成与降解,M期周期蛋白与分裂中期向后期转化,.,4.CDK1活性下降出M期细胞核重建、染色体解螺旋、启动收缩机制。,.,进出S期调控：M期末G1CDKs活性0G1(晚期)增殖信号（激素、生长因子）G1cyclin转录cyclinD+cdk4/cdk6G1/S转换“Start”S期DNA合成启动，cyclin+CDK2（SCDK）保证精确复制（preRC）,.,动物细胞控制S期起始的机制,.,CyclinD与CDK结合使Rb释放转录因子E2F,Rb是G1期向S期转化的负调控因子,.,CDKactivating,活性位点,抑制位点,.,由于某些环境因素的作用细胞周期出现故障或差错，这些信号可是细胞停留在某些点上，称为限制点。主要检验点（4个）：G1/S限制点：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)。S期限制点：DNA复制是否完成？G2/M限制点：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？中-后期限制点：纺锤体组装限制点。,二、细胞周期限制点（checkpoint）*,.,FourCheckpoints,（1）限制点在细胞周期调控中的作用*细胞周期有敏感点，确保细胞周期事件有序进行，检测，修复。Checkpoint：1.DNA损伤检查点2.DNA复制检查点3.纺锤体组装检查点,.,.,细胞周期中4个主要的检验点,.,三、细胞周期长短测定,脉冲标记DNA复制和细胞分裂指数观察测定法流式细胞仪测定法(FlowCytometry)缩时摄像技术，可以得到准确的细胞周期时间及分裂间期和分裂期的准确时间。,.,四、细胞周期同步化,自然同步化:有一种粘菌的变形体plasmodia，某些受精卵早期卵裂。人工选择同步化（药物诱导法）:条件依赖性突变株在细胞周期同步化中的应用：将与细胞周期调控有关的条件依赖性突变株转移到限定条件下培养，所有细胞便被同步化在细胞周期中某一特定时期。,.,有丝分裂选择法：用于单层贴壁生长细胞。优点是细胞未经任何药物处理，细胞同步化效率高。缺点是分离的细胞数量少。密度梯度离心法：根据不同时期的细胞在体积和重量上存在差别进行分离。优点是方法简单省时，效率高，成本低。缺点是对大多数种类的细胞并不适用。,细胞周期同步化方法,.,（2）药物诱导法,DNA合成阻断法：G1/S-TdR双阻断法：最终将细胞群阻断于G1/S交界处。优点是同步化效率高，几乎适合于所有体外培养的细胞体系。缺点是诱导过程可造成细胞非均衡生长。分裂中期阻断法：通过抑制微管聚合来抑制细胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。优点是操作简便，效率高。缺点是这些药物的毒性相对较大。,五、细胞周期中的信号系统调控温度、pH、营养、药物、感染、射线；细胞因子、激素、生长因子（一）生长因子是与细胞增殖有关的信号物质，已知多数能促进细胞增殖，又称有丝分裂原（mitogen）。PDGF、EGF、IL、TGF、FGFNGF等，对G0细胞进入S期有调节作用。,.,生长因子的作用方式信号通路：ras、cAMP、磷脂酰肌醇途径。如通过ras途径，激活MAPK，MAPK进入细胞核内，激活c-myc，myc作为转录因子促进cyclinD、SCF、E2F等G1-S有关的基因表达，细胞进入G1期。,.,六、抑素（chalone)和细胞周期,具有严格的组织特异性和细胞周期阶段特异性。,是一种由细胞自身产生、分泌的，对细胞增殖起抑制作用的糖蛋白，与膜上的受体结合，引起信号转换及在胞内传递，影响细胞周期相关的蛋白的表达。,作用于G1期的抑素可阻止细胞进入S期，称S因子,作用于G2期的抑素可阻止细胞进入M期，称M因子,.,p53、P21及Gadd45在G1阻滞中的作用P53有多种下游效应分子：如MDM2，P21WAFl，Gadd45，Bax,IGFBP3，Fas等。MDM2通过与P53蛋白氨基末端结合来阻止P53蛋白转录激活，形成一个“负反馈环”。MDM2的正常功能是限制GI期阻滞的时间，使DNA损伤修复后的细胞重新进入细胞周期。,.,Gadd45和P21WAFl参与辐射所致细胞G1期阻滞的分子。P53P21wAF1通路是通过CDK周期蛋白活性抑制，Rb脱磷酸化而发挥作用的。Gadd（growtharrestandDNAdamage）是一些生长抑制和DNA损伤诱导的基因，Gadd45是其中一员，也是野生型P53诱导G1期阻滞的一条通路。,.,参与的相关蛋白及其作用：,(1)p21WAF1/CIP1p21基因定位于第六号染色体短臂上(6p21.2），P21蛋白定位于细胞核中，属CKI分子（CDK抑制分子），能广泛抑制各种周期蛋白CDK复合物。野生型P53蛋白作为转录因子可诱导p21WAF1/CIP1基因的表达，抑制CDK2和CDK4对pRB蛋白的磷酸化失活，进而导致G1、G1/S和S期延迟，使DNA损伤有时间得以修复。,.,（2）ATM基因:ATM是AT（毛细血管扩张性共济失调症）唯一致病基因。人类中大约有1%的人是ATM缺失的杂合子，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。,ATM编码蛋白激酶，与损伤DNA结合，信号通路有两条:激活Chk1（checkpointkinase）,使cdc25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中断细胞周期。激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，中断细胞周期。,.,.,(3)P16INK4aP16INK4a基因位于人类染色体9p21区，编码由148个氨基酸组成的分子量为16kD蛋白质。P16INK4a与周期蛋白D1竞争性结合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其对pRB的磷酸化作用，使游离的E2F-1与未磷酸化的PRB结合，依赖于E2F-1转录的基因不能转录，P16INK4a间接抑制包括DNA合成在内的多种生化反应，使细胞周期正常运行。,.,（4）pRB：pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化进行。在周期蛋白CDK复合物与蛋白磷酸酶1的协同作用下，pRB的磷酸化去磷酸化之间的动态平衡有效控制着G1限制点的“开启和关闭”，从而保证细胞周期的有序运行及细胞的正常增殖。,.,生长因子与相应受体结合,通过信号传递促进cyclin基因表达；cyclin与相应的CDK结合为激酶复合物对pRb进行磷酸化；磷酸化的pRb释放其结合并抑制的蛋白,主要是转录因子E2F以及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游离的E2F进入核内,与多种具特殊序列的基因启动子区结合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氢叶酸还原酶、TK及E2F-1基因等),促进这些基因的表达；这些基因的产物促进细胞通过G1/S调控点.CKI通过抑制cyclin-CDK激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍与E2F结合,E2F则不能进入核内发挥