《基因工程的应用》PPT课件

第十章基因工程的应用,第一节基因诱变,一、蛋白质工程,通过蛋白质化学、蛋白质晶体学、蛋白动力学的研究获取关于蛋白质的物理、化学等各方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程将其表达和纯化，最终投入实际应用。,专一改变基因中某一个或某些特定氨基酸的技术。,二、定点突变（site-specificmutagenesis）,加拿大科学家MichaelSmith1985年建立，并与1993年获Nobel化学奖。,1.M13DNA进行的寡核苷酸介导诱变,（1）条件,所要改变的基因编码区的精确的核苷酸序列。,所要引入的氨基酸变化。,（2）方法,取得目的基因。,GGCTTA,CCGAAT,5,5,3,3,插入到双链形式的M13噬菌体载体中,分离出M13正链重组载体,GGCTTA,CCGAATGGCTTA,合成带有突变核苷酸的目的基因寡核苷酸片段,CCGAAG,5,3,带有突变核苷酸的寡核苷酸片段与M13（+）链复性。,错配的核苷酸位于片段的中部，以利于复性杂交。,GGCTTA,CCGAA,5,3,G,以寡核苷酸链作引物，以M13（+）作模板,用Klenow片段合成M13（-）链。,GGCTTA,G,CCGAA,5,3,用T4DNA连接酶连接结成完整的双链,GGCTTA,CCGAAG,转化大肠杆菌，噬菌体DNA在大肠杆菌中扩增，形成一半野生型M13双链DNA，一半突变型M13双链DNA噬菌体。,野生型,CCGAAG,诱变型,GGCTTC,GGCTTA,CCGAAT,（M13的复制型是双链环状DNA）。,母链,（3）缺点：,分离提取M13双链DNA，再转化大肠杆菌，用寡聚核苷酸探针挑选突变型载体克隆。,切下突变基因，接到表达载体中表达诱变的蛋白质。,通常只有1%-5%的噬菌斑含有突变的基因。,（4）改进：,目的基因插入双链形式的M13噬菌体后，转入特殊的受体菌株中。,2.寡核苷酸介导的PCR诱变,（1）方法,将目的基因克隆到质粒上。,在欲突变的位置上设计两对引物，分别带有两条链的突变核苷酸。,ATGCATGCATGCATGC,TACGTACGTACGTACG,ATGAATGCATGC,TACG,ATGCATGCATGCATGC,TACGTACGTACGTACG,CATGC,TACGTACTTAC,P1,P2,P3,P4,分别进行PCR，扩增出线性的全长质粒。,但两组PCR产物的末端位置不同。,TACTTACGTACG,ATGC,ATGAATGCATGC,TACG,GTACG,ATGCATGAATG,TACGTACTTAC,CATGC,PCR产物变性成单链，混合后复性，形成具有粘性末端的杂交双链（1-4；2-3）。,1,2,3,4,TACTTACGTACG,TACG,GTACG,TACGTACTTAC,ATGC,ATGAATGCATGC,ATGCATGAATG,CATGC,环化成有两个切口的开环质粒。用连接酶连接或直接转入细菌（细菌会修复切口）。,1,4,2,3,粘性末端,粘性末端,3.改进型双引物诱变,方法（是目前较常用的方法之一）：,目的基因克隆到M13噬菌体载体中。,分离提取M13单链DNA作模板。,设计两个不同区段的PCR引物，延伸方向一致，其中一个引物的5端磷酸化。,引物1上引入突变核苷酸。引物2对应于载体上的一个单一酶切位点，并将这个位点突变一个核苷酸，使内切酶无法识别。（一般设计在抗菌素抗性基因内）。,ATGCATGCATGCATGC,TACTTACGTACG,欲突变的位点,引物1,CTGGAATTCATGCGAC,GACCTTAAATACG,引物2,单一酶切位点,P,磷酸化,用DNA聚合酶延伸后用T4DNA连接酶连接成杂交双链。,ATGCATGCATGCATGC,TACTTACGTACG,CTGGAATTCATGCGAC,用引物2对应的单一限制性内切酶切杂交双链，会得到模板链被切开一个口但新生的链完整的杂交双链环。,EcoRI酶切口,转化修复缺陷型大肠杆菌。,GACCTTAAATACG,4.重叠延伸诱变,模板链由于已经成为线性分子，且又不能被修复，所以不能在菌体内稳定存在，只剩下新生的突变链在菌体内复制。,目的基因克隆到载体上（不一定是M13）。,设计两对引物：,引物1和引物2是目的基因两端的载体上的通用引物；引物3和引物4是与突变位点对应的反向互补序列。,1,2,CTGCTACGG,GACGATGCC,CTGCTGCGG,GACGACGCC,引物3,引物4,分别以引物1、4和引物2、3为组合进行PCR。结果形成带有突变的基因的左右两个部分。,GACGACGCC,CTGCTGCGG,1,4,CTGCTGCGG,3,GACGACGCC,2,两组PCR产物混合后变性、复性，可能形成下列两种杂交链，其中一种复性方式能够进一步在3端继续延伸，补足全长基因序列。,1G,4C,2C,3G,不能延伸,能延伸,1G,2C,带突变的全长基因,除去多余的引物，用通用引物1、2依次为模板进行PCR扩增。得到含有预期突变位点的基因。,1G,2C,1,2,插入载体进行表达突变的产物。,第二节基因工程生产抗体,每一种生物的生命都始终经受着其他物种的威胁。自然法则之一,一、抗体（antibody）,1.脊椎动物的免疫系统有三种基本的工作形式：,（1）细胞免疫（cellularimmunity）,T细胞中的一类（KillerTcell）杀死被病原感染的细胞。,T细胞中的另一类（HelperTcell）对病原做出反应，分泌蛋白质（淋巴因子）刺激机体作出整体反应（如产生巨噬细胞等）。,（2）淋巴免疫,（3）体液免疫,B细胞分泌抗体与病原结合。,二、抗体的结构和功能,（1）抗体的结构,有两条相同的重链（H）和两条相同的轻链（L）组成的Y字形四聚体。,（2）抗体各部位的功能,抗体的抗原识别位点,位于H链和L链的N端（Y字形的支角上）。,恒定区（C区）,有三个互补决定区（CDR）组成，这三个CDR都位于H链和L链的N端的可变区内（VH、VL）,重链上有3个（CH1、CH2、CH3），轻链上有1个（CL）。,不同的抗体分子的恒定区的差异只有一个或两个氨基酸。,抗体分子的空间结构,（3）木瓜蛋白酶处理后的抗体的结构,木瓜蛋白酶可将抗体分解成3各部分：,两个Fab片段：,属于Y字形的两个角。包含完整的L链和H链的VH和CH1,一个Fc片段,是Y字形的柄部。包括两条重链的CH2和CH3,（4）Fab和Fc片段的功能,Fab具有抗原结合活性和特异性。,其实只要Fab上的VH和VL（合称Fv片断）即可。,Fc片段没有抗原结合活性，但它是抗原结合到抗体上后激发机体免疫反应的主要部位。,三、抗体的表达系统,1.在重组噬菌体中筛选生产抗体,（1）原理：,抗体分子的Fab（Fv片段）是抗原的结合区。,Fv片段编码重链和轻链的基因形成任意组合，然后检测他们与所需抗原的结合能力。,（2）克隆载体,分别克隆H链和L链的Fv片段，形成两种链的cDNA文库。载体或M13载体。,丝状噬菌体（单链环状DNA）。如M13、fd、f1等。,（3）表达载体,Filamentousphagefd,g3p：外壳蛋白3；其余类似。,（3）方法,噬菌体展示（Phagedisplay）：,将外源蛋白（多肽、酶、抗体、DNA结合蛋白）结合到噬菌体的外壳蛋白上形成融合蛋白，表达于噬菌体的外表面。,细菌表面展示（Bacteriasurfacedisplay）,从经过免疫的小鼠或人的B细胞中分离mRNA（既有重链也有轻链的mRNA）。反转录制备cDNA。设计一对重链的引物和一对轻链的引物，通过PCR将重链和轻链的cDNA扩增。用特定的限制性内切酶切PCR产物。,辅助M13噬菌体：噬菌体外壳蛋白基因完整。,从H链文库和L链文库中随机切出H链和L链片段，把酶切后的H链和L链片断连接，随机克隆到M13载体的外壳蛋白3（或8）下游，形成融合蛋白文库。（抗体组合文库）,把重链和轻链的cDNAPCR片段分别克隆到克隆载体中，制成cDNA文库。,构建M13载体：只包含外壳蛋白3（或8基因）、细菌和病毒复制起点。,提取各噬菌斑的重组噬菌体颗粒，与抗原进行亲和分析，寻找结合力最强的噬菌体。,分析亲和力强的载体上的抗体基因组合序列，转到其他的表达载体上表达。,重组载体与辅助载体共同感染细菌，形成有重组的M13外壳（3蛋白或8蛋白上连着抗体片段）的M13（内部所包装的DNA绝大多数是载体，辅助载体DNA复制效率差）。,第三节基因工程生产疫苗,一、传统疫苗,1.民间：,利用天花的干痂来预防天花。,1796年乡村医生EdwardJenner用一种温和的奶牛的疾病牛痘感染人类，发现牛痘感染过的人不会再被天花感染。,2.第一次获得了真正意义上的疫苗,Jenner把从牛逗脓疮中得到的渗出液注射到8岁的小男孩JamesPhipps的体内，经过3次注射后，Phipps对天花有了完全的抗性。,19世纪末，LouisPasteur制成狂犬病疫苗。VonBehring制成白喉病疫苗。KitasatoShibasaburo制成破伤风病疫苗,现在人类已经获得了麻疹、白喉、百日咳、破伤风、天花、脊髓灰质炎等病的疫苗。,3.疫苗的发展,但对艾滋病、疟疾、肺结核等依然束手无策。可能是需要细胞免疫（只有减毒活疫苗才能有效地诱发细胞免疫）。,典型的疫苗主要是灭活的和减毒的致病物质。病源物在培养、纯化后，或者被灭活，或者被降低毒性，但前提是不能丧失其引起免疫反应的能力。,4.疫苗的成分,5.传统疫苗的局限性,（1）有些致病物无法在培养基上生长，所以很多病没办法获得疫苗。,（2）动物和人的病毒需要在动物细胞中培养，成本极高。,（3）培养的动物或人类病毒的生长速度和产量一般较低。（4）需要对实验室和实验人员采取保护措施。（5）疫苗中的致病物质在生产中有可能没有被完全杀死或充分减毒。（6）减毒的菌株有可能发生突变。（7）有些疾病（如AIDS）用传统的疫苗防治效果甚微。（8）绝大多数现行的疫苗的有效期都很短，并需要冷冻保存，不利于在落后地区推广。,二、基因工程疫苗,用基因工程的方法表达出病源物的一段基因序列，将表达产物（多数是无毒性、无感染能力、但有较强的免疫原性）用作疫苗。目前使用的多数乙肝疫苗就属于基因工程疫苗。,1.亚基疫苗（subunitevaccine）,利用病源物的某一部分制得的疫苗称为亚基疫苗。,亚基疫苗非常适合于用基因工程技术生产。避免了直接使用病源物带来的危险。利用纯化的蛋白质作免疫源，避免了由于外源蛋白和核酸的混杂造成的副作用。,缺点,纯化蛋白十分昂贵。纯化后的蛋白的构象可能与在体内时不同，导致抗原性发生变化。亚基疫苗不具备感染性，所以一般不能激活MHCI分子，也就很难激活杀伤性T细胞。,（1）亚基疫苗的优缺点：,优点,（2）亚基疫苗举例,单纯疱疹病毒（HSV）疫苗,衣壳呈20面体，周围有一层无定形的物质（壳皮）覆盖。壳皮外是类脂双层膜。,基因组是线性双链DNA，长152.5kb，含有末端重复序列和内部重复序列。,TRL,长独特区UL,IRL,IRS,短独特区US,TRS,长基因组区,短基因组区,HSV的核心是缠有DNA的纤丝卷轴，纤维的末端在衣壳下侧固定。,HSV颗粒中至少有33种蛋白，其中一半是糖蛋白。制备亚基疫苗的基本前提是鉴定出哪些成分能激发机体产生抗体。HSV-1型的衣壳蛋白D（gpD）就是能引起老鼠产生完整的HSV抗体的成分。,gpD是个膜蛋白，把其跨膜区删除，成为分泌蛋白，成为疫苗。,膜,N端（膜外）,C端（膜内）,跨膜区,膜,C,N,改造过的gpD,口蹄疫病毒（FMDV）疫苗,传统的口蹄疫疫苗是用甲醛灭活的口蹄疫病毒。,FMDV中得到抗体产生的主要成分是病毒衣壳蛋白1（VP1）。,（foot-and-mouthdiseasevirus）FMDV是单链RNA病毒。对牛和猪有极强的毒性。,将VP1的cDNA克隆表达、纯化。,2.肽疫苗,衣壳蛋白组成的外壳,病毒衣壳,病毒核酸,动物病毒结构,根据动物病毒的结构，可以推测：,只有位于衣壳外表的蛋白结构域才能引起免疫反应。因此只需要合成衣壳蛋白的抗原决定簇（小肽）就可以当作疫苗。,VP1C端的3个肽段（141-160aa、151-160aa、200-213aa）和N端的3个肽段（9-24aa、17-32aa、25-41aa）分别接到载体蛋白上（提高小肽的稳定性）。,结果：141-160aa的肽段能诱导豚鼠产生足够的FMDV抗体。如果把141-158aa与200-213aa两个肽段连起来，不用载体蛋白稳定就能激发豚鼠产生高水平的抗体。比任何一个肽段单独使用更有效。,把VP1的142-160aa序列于具有强免疫源性的载体蛋白乙肝抗原蛋白（HBcAg）连接，会自动组装成“27nm”颗粒，VP1的小肽恰好位于颗粒外表面。这可能成为未来投送肽疫苗的常规方法。,肽疫苗的局限性：,肽段不能太长、肽段的构象与抗原决定簇的构象要一致、必须有足够强的免疫源性。,3.活体重组疫苗,用基因工程的方法对细菌和病毒进行改造，使之成为活体重组疫苗（liverecombinantvaccine）,组成：,可以是非致病的微生物，用基因工程方法使之带上并表达某种特定病源物的抗原决定簇基因，产生免疫原性。,也可以是本来的致病微生物，通过基因改造去掉毒性基因后仍保持免疫原性。,霍乱活体重组疫苗的制作,病原菌：霍乱弧菌（Vibrocholerae）,致病物：肠毒素。,肠毒素的结构：,1个A亚基和5个相同的B亚基。A亚基有ADP糖基化活性，有两个功能域：A1肽（毒性区，194aa）、A2肽（连接A1和B亚基）。,亚基疫苗对霍乱菌的感染没有免疫作用。,利用重组DNA技术破坏A1肽的基因序列，使突变的菌株不能产生肠毒素，成为非致病菌，做疫苗。,4.细菌疫苗,在非致病菌的细胞表面插入致病菌的表面抗原。,在细菌的鞭毛蛋白的高变区基因中插入霍乱菌素B亚基的50个氨基酸的DNA片断。然后把重组DNA导入无鞭毛的沙门氏菌株。,实验证明转入后的表达产物既有正常的鞭毛功能，又能激发小鼠产生高水平的针对霍乱菌素的抗体。,5.肿瘤疫苗,肿瘤疫苗的应用基础是存在肿瘤特异性抗原，同时免疫系统对该抗原能够产生有效的应答。,(1)肿瘤细胞疫苗,用肿瘤细胞作为抗原而制备的疫苗（必须事先灭活）。,（2）基因工程肿瘤疫苗,将不同的外源基因导入肿瘤细胞后再制成疫苗。,机理不十分清楚、效果很差。仍需努力。,6.DNA疫苗,1993年Wolff等意外地发现将DNA直接注射到小鼠骨骼肌细胞后可直接引起特异性免疫反应，而且可以持续2个月以上。,1994年和1995年WHO和美国科学院分别召开专题会议讨论DNA免疫的应用前景。,流感病毒的核心蛋白抗原（NP）,表达载体,小鼠骨骼细胞,流感病毒,小鼠存活率提高50%！,（1）DNA疫苗的构成,DNA疫苗是指含有一种病原体抗原编码基因的重组质粒DNA。,抗原编码基因,对于不易变异的病原：,选用病原体表面糖蛋白编码基因。,对于容易变异的病毒：,选择各型共有的核心蛋白基因中的保守DNA序列。,i）选用,ii）抗原编码基因的分离和筛选,表达文库免疫技术（ELI）,Expression-libraryimmunization),基本原理：,病原体的DNA片段,特定的质粒,病原基因文库,分别进行DNA免疫测试,筛选病原基因组中最具有免疫激活反应的DNA片段,质粒表达载体,大多数采用pUC系列的质粒基本骨架。,基本组成元件：,细菌复制起点（ColEIori）。细菌抗性基因（Ampr、Kanr）。PolyA加尾信号。CpG序列（增强DNA免疫活性）。哺乳动物强启动子（CMV、SV40）。,CMV：cytomegalovirus（巨细胞病毒）。,（2）DNA疫苗的作用机理,与重组亚基疫苗类似，都是利用单一的蛋白质抗原分子来诱导免疫反应。,（3）DNA疫苗的优点,既能诱导体液免疫，又能诱导细胞免疫。同一个质粒上可以容纳多个抗原基因，有可能获得对多种疾病的免疫能力。DNA比蛋白质容易制备和保存。,（4）DNA疫苗的缺点,普遍存在免疫效力低的问题。安全性问题（整合位点、后果）,（5）DNA疫苗的改进,载体的优化,增强载体的表达能力：如采用增强子启动子复合物。,提高载体的复制能力：（DNA疫苗不能自我复制）,甲病毒（alphavirus）是个负链RNA病毒，编码复制酶（具有自我水解功能）。可以在寄主细胞内独立复制。有可能利用该病毒作载体（用外源基因替换其结构基因）。,用CpG序列优化载体：,试验表明适当长度的非甲基化的CpG序列对提高DNA疫苗的免疫原性具有重要的作用。,第四节人类疾病的基因治疗,迄今为止，还没有遗传病患者经传统的治疗方法治疗后能过上正常人的生活，他们的后代也同样难逃厄运。,临床统计：,25%的生理缺陷、30%的儿童死亡、60%的成年人疾病都是由遗传疾病引起的。,一、基因治疗的回顾和现状,（1）基因治疗的概念,向靶组织或细胞中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。,（2）基因治疗的发展,1973年一名美国医生在德国给一对姐妹（缺少一种稀有的酶）注入肖普氏乳头瘤病毒，结果无效。,第二例是在1980年，美国一名医生对两名地中海贫血患者进行基因治疗。由于未得到NIH的批准，受到广泛的抨击。,后来开始在动物身上进行试验。,NIH及其下属的重组DNA顾问委员会经过长期的审查，终于批准了美国第一例临床治疗申请。1990年9月14日正式开始，由Genetictherapy公司和NIH。患者：两位患严重综合性免疫缺损症（SCID）（缺少腺苷酸脱氨酶（ADA）的姑娘。,第一位接受基因治疗的人,AshantiDiSilva,方案：把克隆的腺苷酸脱氨酶基因转入患者的T淋巴细胞，培养后再转入患者体内。疗效：AshantiDiSilva的症状有所改善，25-30%的T细胞能维持正常的ADA水平，至今生活正常。,但与她同时接受治疗的另一位女孩失败了。,1991年Rosenberg等对50名黑色素瘤晚期患者进行基因治疗，取得一定的效果。,迄今为止，所有的基因治疗方法都是针对体细胞的，处于伦理、安全、技术上的考虑，性细胞基因治疗方案尚未被列入研究日程。,方案：把外源的肿瘤坏死因子基因转入肿瘤侵润淋巴细胞（TIL），结果这种TIL能集中在肿瘤所在的部位杀死肿瘤细胞。,二、体细胞治疗的生物学问题,（1）如何选定并获得用来进行基因治疗的细胞。（2）如何将修正的目的细胞重新引入患者体内。（3）如何控制转入的正常基因的表达。（4）转基因细胞能否在体内增值。,三、基因治疗的方案,1.体外原位（exvivo)基因治疗,把病人的体细胞取出，在体外加入正常基因校正，再把校正的细胞放回病人体内。已批准了100多个临床方案。,2.体内（invivo）基因治疗,原位：将新基因直接引入病人的疾病部位（病毒载体或DNA)。,通过血液把治疗性基因带到病组织。,引入目的基因的mRNA的反义序列，与目的基因的mRNA相配对，造成供翻译的mRNA大量减少，制止病基因的表达。也可以引入目的基因的反义DNA。,3.反义（antisense）基因治疗。,反义RNA的作用,反义寡聚RNA与mRNA形成双链后，诱使RNaseH把mRNA切断,核酶是一类具有催化活性的RNA分子。参与细胞内多种RNA及其前体的加工和成熟过程。,4.核酶（ribozyme）基因治疗。,发现者Altman和Cech获1989年诺贝尔化学奖。,1988年，Haseloff和Cerlsch根据核酶RNA的锤头结构设计出第一个具有特异切割活性的人造核酶，并在体证实它确实具有特异性的切割活性。,其中利用核酶抗HIV感染的工作尤其受到重视。细胞实验表明，核酶确实具有切割HIV基因组并阻断其复制的效果。,四、基因治疗用的载体,1.反转录病毒载体,主要是病毒。,反转录病毒（ritrovirus）属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。两个相同的RNA分子在5端附近经氢键连接形成70SRNA，这种结构可能在逆转录过程中起调节作用。,基因组结构：类似于真核细胞mRNA,反转录病毒一般只感染处在分裂状态的细胞。,反转录病毒结构,流感病毒,HIV,如Moloneymurineleukemiavirus(MoloneyMLV),env,pol,gag,U3,U3,U5,U5,cap,polyA,3,5,LTR,LTR,U5、U3：5段或3端独特序列。,LTR：长末端重复序列。在病毒基因组整合中至关重要。整合时，整合酶在U5-U3连接处切开双链DNA，随机插入到宿主基因组里。LTR本身还具有启动子和polyA加尾信号的功能。,R,R,+,+：组装时必需的非编码序列。env：外壳蛋白。pol：反转录酶和整合酶。gag：核心蛋白。,（1）反转录病毒载体的优点,能稳定地将DNA插入宿主基因组的随机位点上。侵染范围广、感染率高。整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低。包装的外源DNA可达10kb。反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。,（2）用于基因治疗的反转录病毒载体构建,把反转录病毒基因组中的整个pol、env和gag基因的3端删除。插入标记基因（如neor）。外源基因和启动子插入到+下游。,5LTR,+,外源基因,neor,3LTR,反转录病毒DNA转化细胞的效率很低，必须包装成病毒颗粒转染细胞。,用两个缺失了+的反转录病毒染色体转化细胞，以制造病毒外壳蛋白。,（3）包装细胞系的构建,5LTR,gag,3LTR,pol,env,3LTR,5LTR,病毒外壳蛋白,包装细胞,（4）载体RNA的包装,用载体DNA转化包装细胞系,转入的载体上带有+，转录成的载体RNA就会被包装细胞中原有的病毒外壳蛋白识别包装成重组病毒颗粒。,5LTR,+,外源基因,neor,3LTR,（5）利用这种重组病毒颗粒，高效转染靶细胞进行基因治疗。,2.腺病毒（adenovirus）载体,（1）腺病毒的基因组：,（2）腺病毒的优点：,比较安全，无致病、致癌、致畸作用。宿主范围广，不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。,线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。共同特点是都带有倒置的末端重复（ITR），在病毒的复制过程中起非常重要的作用。,腺病毒的结构,可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式进行基因治疗。载体中的插入片段可达7.5kb（有包装容量限制）。腺病毒容易制备、纯化。基因组结构和功能了解得清楚。,是目前最常用的基因治疗载体之一。,把腺病毒DNA删除一些非必须区（如E1或E3区），增加插入能力。,构建质粒，含有E1或E3区两侧的同源序列。两侧序列之间插入外源基因和选择标记基因。,（3）腺病毒载体的构建,用同源重组的方法插入外源基因。,ITR,E1,ITR,E3,把质粒切成线性。,质粒与病毒DNA（缺失E1或E3）共同转染细胞，在细胞中发生同源重组，把外源DNA加到病毒基因组中。,分离重组腺病毒，成为基因治疗的载体。,（4）重组腺病毒DNA在细胞中的生存,以游离的附加体形式存在于细胞中，不能整合到细胞基因组中。基因表达时间短。E1是腺病毒繁殖的必须区。缺失E1的重组腺病毒必须在已经被腺病毒（辅助病毒）感染的细胞中繁殖。E3区在腺病毒的繁殖过程中不是必需的。缺失E3的重组腺病毒不需要辅助病毒。,五、癌症的基因治疗,国际上已批准的130多种基因治疗方案中，70%是针对癌症的。,（1）癌症的基因治疗中常用的治疗性基因,直接杀伤或抑制癌细胞生长的基因：,抑癌基因、癌基因的反义序列、编码细胞程序性死亡的基因等。,可提高免疫系统能力的基因：,细胞因子基因等。,（2）导入抑癌基因的基因治疗,多种药物的耐药性基因：,主要目的是提高造血细胞及其他细胞对放疗、化疗及其他抗癌药物的耐受性。,癌症一般是一对抑癌基因都发生了失活突变。因此导入一个抑癌基因能抑制癌细胞的生长甚至使肿瘤细胞逆转。,如抑癌基因：Rb、P16、P21、P53、Dcc等。,（3）针对癌基因的基因治疗,用反义疗法导入癌基因的反义DNA或RNA，使癌基因产物减少。,如k-ras的反义基因。,（4）用“自杀基因”（suicidegene）,将一种基因转入癌细胞，这种