真菌DNA提取方法.doc

一、SDS法基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。1、 试剂(1)提取缓冲液Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）EDTA 50mmol/L （pH8.0）NaCl 500 mmol/L灭菌后加-巯基乙醇至10 mmol/L(2)裂解液20%SDS(3)高盐溶液5mol/L KAc(4) RNaseA 10mg/ml(5) 异丙醇(6)灭菌ddH2O或TE2、 仪器 离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置3、实验程序（1）、离心菌体，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500L提取液的离心管中,轻轻混匀。（2）、 向管中加入50L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ，65保温10min，并不时摇动。（3）、 加入150L 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。（4）、 4,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20沉淀30 min 。（5）、12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。（6）、 加入1/10体积的RNaseA，37保温20min，除去RNA。（7）、 C：I抽提后，加2V乙醇，-20沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。（8）、 用400L 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2 O或TE溶解DNA。（9）、 电泳检测完整性。二、lysed cells directly by phenol（一）、试剂：1、STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)2、TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)（二）、实验程序1、。离心菌体2、400 l STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)洗2遍3、8000g for 2 min4、The pellets were resuspended in 200 ll TE buffer (10 mMTris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)5、50 mg of 425600 m size-fractionated glass beads (Sigma) were added to the cell suspension.6、100 l Tris-saturated phenol (pH 8.0) was added to these tubes, followed by a vortex-mixing step of 120200 s to lyse cells.7、13 000g for 5 min at 4 to separate the aqueous phase from the organic phase.8、160 l upper aqueous phase was transferred to a clean 1.5 ml tube.9、40 l TE buffer was added to make 200 l and mixed with 100 l chloroform10、centrifuged for 5 min at 13 000g at 4 11、Lysate was purified by chloroform extraction until a white interface was no longer present; this procedure might have to be repeated two to three times.12、160 l upper aqueous phase was transferred to a clean 1.5 ml tube.13、40 ll TE and 5 l RNase (at 10 mg/ml) were added and incubated at 37 for 10 min to digest RNA.14、Then 100 l chloroform was added to the tube, mixed well and centrifuged for 5 min at 13000g at 4 .15、150 l upper aqueous phase was transferred to a clean 1.5 ml tube.16、The aqueous phase contained purified DNA and was directly used for the subsequent experiments or stored at -20 .三、蜗牛酶破壁法（一）、试剂：1、500 L PBS（0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl）2、蜗牛酶溶液中（0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 m 细菌滤膜过滤除菌）3、裂解液（2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L T 、Tris-HCl，pH8.0, 1mmol /L EDTA）4、5mol/L KAc( pH 8.9)（二）、实验程序1、离心菌体，沉淀中加入500 L PBS（0.01 mo l/L N a2 HPO4 和N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl）重悬, 12 000 r /m in 离心2 m in; 弃上清, 重复悬浮一次2、沉淀溶于100 L 含20 mg /mL 的蜗牛酶溶液中（0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12用0.22 m 细菌滤膜过滤除菌）3、45 作用2 h4、加100 L 裂解液（2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L T 、Tris-HCl，pH8.0, 1mmol /L EDTA）5、- 20 冷冻, 然后室温震荡溶解, 反复3次6、向悬浮液中加入150 L 5mol/L KAc( pH 8.9)轻轻混匀7、10 000 r/min离心5 min; 将上清转移到一新的1.5 mL离心管中8、乙醇沉淀四、改良CTAB法1、取1.5 mL 菌液，12000rpm*2min，MQ洗2遍2、加入500 L 5CTAB(含1 -巯基乙醇), 液氮中速冷30 s, 立即65 30 s, 反复3次3、加入1/3 体积的玻璃珠, 漩涡振荡器上高速振荡4 min5 min4、65 保温20 min , 每隔10 min摇匀1 次5、加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V/V), 12000 r/min 离心 10 min6、将上清液移入到新的离心管中, 加入等体积的氯仿: 异戊醇 (24:1,V/V), 12000 r/min 离心 10 min 。7、在上清中加入2 倍体积预冷的无水乙醇,20静置20 min30 min, 12000 r/min 离心10 min。8、倒掉上清, 加70的酒精200 L 洗沉淀,室温干燥9、加入100 L TE 使DNA 完全溶解10、加入RNase A (10 mg/mL) , 65保温30 min以上11、重复7-9，最后DNA 溶于30 L ddH2O 中。五、亚精胺对DNA进行纯化利用亚精胺对含多糖、多酚类物质较多的植物、真菌等材料的DNA进行纯化，以去除杂质，利于后续试验。1、加入400lTris-HCl（100mM 8.0），溶解DNA2、400l亚精胺（5mM）振荡3、4 ，放置15分钟4、4 ，17000g，离心15分钟，弃上清5、加400l盐溶液（10mM MgCl2、300mM NaCl2），400l异丙醇，振荡，室温放置15分钟。6、17 000g，离心15分钟7、70%乙醇，轻摇，洗涤8、晾干后溶解。六、TRIzol1、离心菌体，MQ洗2遍2、液氮研磨3、加1 ml TRIzol每5-10*106 Yeast cells，反复吹吸 4、15-30*5min5、0.2 ml 氯仿，混匀15sec，然后15-30*2-3 min6、12000g*15min at 4 7、去除水相8、0.3 ml无水乙醇沉淀中间相和有机相，颠倒混匀，15-30*2-3 min9、2000g*5min at 410、去除苯酚-乙醇上清11、沉淀（含DNA）用1ml洗液（0.1M柠檬酸钠，1