白色念珠菌与抑菌效力检查方法

.,白色念珠菌检查方法,1、增菌培养取供试液10ml（相当于供试品1g、ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养4872小时。2、分离培养取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。,.,结果判断,白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。,.,2、如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选23个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养2448小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。3、若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉米琼脂培养基上，培养2448小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。,.,4、芽管试验挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置3537、13h，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。5、若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。,.,抑菌剂效力测定,概述1、抑菌剂效力检查法系用于测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导生产企业在制剂研发阶段抑菌剂的确定。2、如果药物本身不含有充分的抗菌活性，那么应根据制剂特性（如水溶液制剂）添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常储存和使用过程中可能发生微生物污染和大量繁殖尤其多剂量包装的制剂，避免因药物微生物污染及对患者造成伤害。,.,3、所有抑菌剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品的质量和用药安全，添加防腐剂的量应根据制剂本身是否具抗菌活性，保持最低有效量并在药品包装上注明添加抑菌剂的名称和数量。,.,培养基1、胰酪胨大豆肉汤培养基2、胰酪胨大豆肉汤培养基3、沙氏葡萄糖肉汤培养基,.,培养基的适用性检查,菌种铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa）金黄色葡萄球菌（staphycococcus）白色念球菌（Candidaalbicans）黑曲霉（Aspergillusniger）大肠埃希菌（EscherichiaColi）菌液的制备同控制菌培养基适用性检查,.,适用性检查,取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注胰酷胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置3035培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50100cfu，分别注入无菌平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置2025培养72小时，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。,.,结果判定,被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。,.,抑菌剂效力测定,供试品分类为了达到试验目的，根据供试品的给药途径和用途将供试品分为四类，以便标准的制定和执行，但对于一些抗酸性制剂和含活生物制剂应考虑会降低有益菌的生物活性。见表,.,表产品分类类别药品1类注射剂、其他非肠道制剂，包括乳剂、耳用制剂、无菌鼻用制剂及眼用制剂2类局部给药制剂、非灭菌鼻用制剂及用于黏膜的乳剂3类口服非固体制剂（非抗酸制剂）4类非固体抗酸制剂,.,菌种和菌液的制备同培养基适用性检查供试品接种1、抑菌剂效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作的接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行贮存。,.,2、若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的PH，PH对抑菌剂的活性影响很大，同时容器的口径大小应便于供试品的进出及混匀。,.,3、取包装完整的供试品至少5份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移至5个适宜的无菌容器中（若试验菌侏数超过5株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种一个试验菌。,.,4、1、2、3类供试品1g或1ml接种菌量为105106cfu，4类供试品中1g或1ml接种菌量为106108cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的05%1%，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布。5、将接种的供试品在试验期间置2025，避光贮存，贮存温度的变化应尽可能控制在最小范围，并防止被污染。,.,存活菌数测定,由于供试品中含有抑菌活性，所以菌数测定方法应进行验证。根据菌数测定结果，计算1ml(g)供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。,.,测定细菌用胰酷胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基根据产品类型，在规定的接种时间，分别从上述每个容器中取供试ml(g)，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释成1：10、1：102、1：103等稀释级。,.,结果判断,1、抑菌剂效力根据各间隔时间测定的菌数1.0lg值相对于初始值（0时菌数1.0lg值）减少程度进行评价（见表），试验结果按有效数字的修约规则进舍，保留一位小数点。结果符合表，要求可判断该产品抑菌效力符合规定。,.,表防腐剂抗菌效力标准,1类供试品细菌7天菌数下降不少于1.0lg，14天菌数下降不少于3.0lg，第14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，到7、14、28天菌数均不增加。2类供试品细菌14天菌数下降不少于2.0lg，14天到28天菌数不增加。真菌与初始值比，到14、28天菌数均不增加。3类供试品细菌14天菌数下降不少于1.0lg，14天到28天菌数均不增加。真菌与初始值比，14、28天菌数均不增加。4类供试品细菌，真菌与初始值比，14、28天菌数均不增长。注：1、表中“不增加”是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5lg。2、0时菌数供试品加入试验菌，摇匀，立即取样检查，培养，计数，为0时,.,举例,1、氯化钠注射液、碳酸氢钠注射液不含抑菌剂加入菌从初始到6h就开始无限增加，不具抑菌力，抗病毒口服液从初始到24h对数值无变化，72h后明显降低，具一定的抑菌力。2、呋麻滴鼻液、硫糖铝混悬液、阿昔洛韦滴眼液、鲸脂滴耳液、洁尔阴洗