实时荧光定量PCR介绍

April27,2020,实时荧光定量PCR介绍,宝生物工程（大连）有限公司,主要内容,RealTimePCR基础知识,RealTimePCR的用途,RealTimePCR的原理,使用RealTimePCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。,RealTimePCR,RealTimePCR基础知识,TaqManProbe,CyclingProbe,MolecularBeacon,etc.,SYBRGreenI,荧光染料嵌合法,荧光探针法,RealTimePCR的检测方法,荧光染料嵌合法（SYBRGreenI）,SYBRGreenI：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。,SYBRGreenI,F,SYBRGreenI法作用机理示意图,TaqMan法作用机理,TaqMan探针为一寡核苷酸，5端标记一个报告基团（Reporter），3端标记一个淬灭基团（Quencher）。,Q,TaqManProbe法原理示意图,SYBRGreenI法与Probe法比较,常用于mRNA表达量分析等,SYBRGreenI法,简便易行,价格便宜,要求反应的特异性,不能进行多重PCR,常用于SNP解析，病毒、病源菌检测,主要内容,RTPrimer的选择,RandomPrimerOligodTPrimerGeneSpecificPrimer,Random6merPrimer,GeneSpecificPrimer,OligodTPrimer,PCRR-Primer,PCRF-Primer,RTPrimer的选择,RealTimePCR引物设计,目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。,目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。,RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同,=对引物设计要求严格,普通PCR引物,RealTimePCR引物,RealTimePCR引物设计原则,RealTimePCR用TaqMan探针设计原则,RealTimePCR探针设计原则,线性关系、扩增效率确认,检测灵敏度确认,PCR扩增效率（E）：0.8-1.2,35Cycles内可得到好的定量结果。如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。,相关系数（r2）：大于0.98,反应性能确认,主要内容,标准曲线制作,扩增曲线,标准曲线,标准品梯度的选择：56个梯度标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10,105104103102101100,105104103102101100,标准品的种类,质粒标准品构建流程,基因组DNA,PCR,目的基因克隆,目的基因,目的基因,目的基因,质粒,质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。,体外转录RNA标准品构建流程,RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101copies/ul，作为标准品。,T7RNApolymerase,体外转录RNA,TotalRNA,PCR,cDNA,RT,T7Promoter,TTTTT,PCR产物,目的基因,目的基因,目的基因,AAAAA,AAAAA,理想的标准品扩增曲线,基线平整NegativeControl为水平线指数区较明显，陡度大平台区汇于一起线性范围宽,理想的标准曲线,相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。,扩增效率,相关系数,扩增效率（E）计算方法,标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时E=10-1/a-1标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10)E=10-a-1,RealTimePCR解析方法,融解曲线分析,Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。,SYBRGreenI法进行检出时，要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。,特异性产物,非特异产物,引物二聚体,对PCR产物特异性进行分析,融解曲线分析,RealTimePCR解析方法,绝对定量解析方法,提取样品,引物设计,标准品制备,RealTimePCR反应,数据分析,流程,绝对定量解析方法,通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。,105,104,103,101,扩增曲线图,标准曲线图,检测样品,检测样品,102,相对定量解析方法,以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正，进行相对表达量分析。,进行相对表达量分析必要性,实际上目的基因表达量分析,相对定量解析方法,管家基因维持细胞基本代谢活动所必须的基因,如：GAPDH、-actin等。,筛选方法,根据文献提供通过具体实验筛选,主要内容,绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,检测方法TaqManprobe法检测样品3个从SARS样品中提取的TotalRNA目的基因SARS病毒RNA内参SARSInternalControlRNA标准品SARSControlRNA试剂OneStepPrimeScriptRT-PCRKit（PerfectRealTime）（DRR064）仪器SmartCycler,pBluescriptIISK(+)Vector,T7Promoter,SARSControlRNA构建,绝对定量应用例对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量,纯化的SARSControlRNAOD值测定结果,体外转录的SARSControlRNA电泳照片,M1M2,M1:-HinddigestM2:DL2,000Marker,DNaseI处理前,DNaseI处理后,绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,DNA,T7Promoter,SARSInternalControlRNA的构建,pBluescriptIISK(+)Vector,绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,探针的选择,绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,SARSControlRNA105-101扩增曲线,SARSGenomicRNASample1、扩增曲线,SARSInternalControlRNA扩增曲线,标准曲线,绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,定量结果,对三个样品所含SARS病毒RNA进行了准确定量。,绝对定量应用例对SARS样品中所含SARS病毒RNA进行定量,相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,检测方法SYBRGreenI荧光嵌合法管家基因GAPDH基因目的基因PAH基因标准品cDNA试剂PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（DRR047）SYBRPremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)（DRR820）仪器ThermalCyclerDiceRealTimeSystem（TP800）,TotalRNA提取,TotalRNA基因组DNA去除,标准品RNA制备,标准曲线制作及预实验,详细的实验资料获取,实验设计及引物设计、合成,样品RealTimePCR反应,相对定量计算及数据分析,数据整理及论文撰写,相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,提取TotalRNA后电泳照片,提取试剂：TaKaRaRNAisoPlus（D9108）,相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,MCLBM,M：DL2,000DNAMarker,C：ControlRNA,L：LiverRNA,B：BrainRNA,目的基因标准曲线制作结果,扩增曲线图,融解曲线图,标准曲线图,管家基因标准曲线制作结果,相对定量应用例分析小鼠不同组织中PAH基因表达量的变化情况,扩增曲线图,样品目的基因定量结果,样品管家基因定量结果