生工093生物技术制药课堂重点总结ppt课件

.,第一章,生物制药：是指利用生物体或生物过程生产药物的技术。主要阐述生物药物，特别是生物工程相关药物的研制原理、生产工艺分离纯化、制剂和生物药品分析技术的应用学科。,.,生物制药分为：,狭义生物技术药物广义生物技术药物,.,即基因工程产品、抗体工程产品或细胞工程产品，如用大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞表达的重组蛋白用杂交瘤技术生产的治疗性抗体，用细胞培养技术制备的组织工程产品等。,.,包括从血液、尿液或组织中提取的生物活性物质，用细胞培养方法生产的减毒或灭菌疫苗等。,.,生物医药行业特性,1、高技术2、高投入3、高风险4、长周期5、高收益,.,GLP药物非临床研究质量管理规范GCP药物临床试验质量管理规范GMP药品生产质量管理规范GSP药品经营质量管理规范GAP中药材生产质量管理规范,需要牢记的几个缩写,还有哦,.,药品质量及检测应遵循中华人民共和国药典。五年修订一次。,.,新药研究中的两个重要原理,1、前药原理2、生物电子等排体原理,.,前药是指对现有药物显效基因进行封闭体外无活性的衍生物，在体内经酶或非酶作用原药，从而产生生物活性，则称这种结构修饰后的化合物为原药的前药。利用这一原理进行新药设计的方法称为“前药原理”。,.,狭义的电子等排体是指具有相同原子数及电子总数，而且电子排布状态也相同的不同分子或原子团，如N2与CO,H2O与CO2。,.,广义的电子排体是指具有数目的外层电子（价电子）的不同分子或原子团，而不管原子及电子总数是否相等，这样，电子等排体的数目就大大增加了，如F,Cl2,Br,I是电子等排体；F,NO,NH2,CH2是电子等排体；-O-,-NH-,-CH2-是一组电子等排体等。,.,制药工程的研究对象,药物生产过程共性规律及其应用包括：制备原理+工艺路线+质量控制。,.,第二章：药物概论,生物药物：是指运用生物学、医学、生物化学等研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学，生物技术、药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗、诊断的制品。,.,蛋白质类药物分离纯化方法：,沉淀法：原理是使蛋白质胶体颗粒的表面水化膜或表面电荷破坏从而使其沉淀，常用盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、靶物质结合沉淀法（抗原抗体）等。按分子大小分离方法：超滤法、透析法（膜分离法）、凝胶过滤法、超速离心法等。,.,按分子所带电荷进行分离方法：氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为二性电解质、具有等电点，在远离等电点的pH时便会带正电荷或负电荷。包括离子交换层析法、电泳法、等电聚焦等。亲和层析法：大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如酶和底物、抗原和抗体、激素和受体等，它们之间有特异的亲和作用，利用该性质进行的特异层析分离技术称为亲和层析，专一性强。,.,第三章：基因工程制药,1、基因工程菌：微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制表达自身基因的工程生物体。种类：细菌和酵母是重要的表达重组药物的制药生物。2、质粒载体包括三个位点：复制起始位点、选择标记位点、多克隆位点。3、质粒类型：严紧型、松弛型、克隆质粒、测序质粒、整合质粒、穿梭质粒,.,4、大肠杆菌的表达产物基本上都是以包涵体形式释放的。产物表达形式：（1）不溶性蛋白质:细胞质内形成包涵体。（2）可溶性蛋白质：存在于细胞质（3）周质表达：外源蛋白质被运输到周质，避免N端附加蛋氨酸。（4）胞外分泌表达5、包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体、包括目标蛋白、菌体蛋白等，目标蛋白的一级结构是正确的但立体结构是错误的，所以没有生物活性。,.,包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内形成不溶性的包涵体。6、包涵体的纯化方法：收集菌体细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性,.,7、工程菌的构建流程：（1）目标基因克隆（1）PCR、文库、化学合成（2）表达载体构建（2）酶切、连接（3）遗传转化与筛选（3）外源基因导入与培养（4）工程菌,.,8、转化后的细胞类型：（1）非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞。（2）转化子：导入外源DNA的转化细胞（3）非重组子：仅含有空载体的转化子（4）重组子：含有重组DNA的转化子（5）目标重组子：含有正确连接的重组子（6）非目标重组子9、诱导性工程菌主要是温度和甲醇诱导。,.,9、温度影响：大肠杆菌和酿酒酵母生长的最低温度为10。大肠杆菌的最适温度是37，最高为45。酵母菌的最适温度是30，最高为40。pH影响：大肠杆菌的最适pH为6.57.5，酵母最适pH为5.06.0.10.干扰素：机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似功能接近的细胞因子。功能：干扰病毒在细胞内增值。,.,第四章、抗体制药,1、抗体：能与相应抗原特异结合具有免疫功能的球蛋白。2、抗体产生：抗原免疫系统B淋巴细胞浆细胞抗体3、多克隆抗体：多种抗体混合物。,.,单克隆抗体的概念。单克隆抗体用于疾病的诊断和治疗单抗纯化：1、离心2、分离单抗的特性有哪些？体内免疫法（适用于免疫原性强，抗原量较多）体外免疫法（需抗原量少，免疫期短）,.,杂交瘤技术,1、聚乙二醇PEG使免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合。2、HAT培养基的选择培养H次黄嘌呤A氨基蝶呤，叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径T胸腺嘧啶核苷，供细胞通过替代途径合成DNA3、单克隆抗体的产生,.,HAT选择作用淋巴细胞不能生长骨髓瘤细胞不能生长杂交瘤细胞能生长杂交瘤细胞鉴定单抗进行鉴定,.,基因工程抗体制备的概念，包括哪几类。抗原和抗体的结合位点？抗体是具有4条多肽链的对称结构，其中2条较长、相对分子量较大的相同的重链（H链）；2条较短、相对分子量较小的相同的轻链（L链），整个抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。可变区位于“Y”的两臂末端。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区。高变区氨基酸序列决定了该抗体结合抗原抗原的特异性，称为抗原结合片段。,.,第五章,动物细胞培养制药技术,.,动物细胞培养中细胞分类,按来源分：原代细胞、传代细胞按寿命分：有限细胞系、无限细胞系按染色体数目：二倍体细胞系、异倍体细胞系按获得方式：工程细胞系、癌变细胞系生长特性：贴壁依赖型、非贴壁依赖型、兼性细胞系,.,原代细胞：从动物体内直接分离得到的细胞。特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似应用：药物检测、实验、药理研究生产药品：鸡胚细胞、兔或鼠肾细胞、淋巴细胞,.,传代细胞：原代细胞转接后培养的细胞特点：细胞分裂增殖旺盛,.,有限细胞系：生长和寿命有限的细胞系，如二倍体细胞系特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡，其寿命取决于细胞来源的物种和年龄、器官。,.,无限细胞系：生长和寿命不受限制，能连续传代培养特点：细胞无限分裂、不具接触抑制现象、不出现异常染色体转化细胞系：染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力特点：长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求低，适用于大规模工业化生产,.,工程细胞系：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造和重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系获得方法：正常细胞异倍体化、融合或重组,.,培养条件,动物细胞培养液是液态培养基，主要成分是水，糖类，氨基酸单体，无机盐，生长因子和动物血清等。动物血清可以提供必不可少的营养物质。温度：哺乳动物细胞最佳培养温度37氧浓度：高氧环境（60%以上）对细胞毒性较大，抑制细胞生长和增值，出现染色体异常现象，有时充氮气以稀释氧浓度。pH:6.87.6生长因子与激素：除细胞生长、增值所需生长因子外，需加入贴附因子（细胞贴壁生长必需）,.,接触抑制：细胞在生长基质中分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围细胞相互接触时，就会抑制细胞增殖。,.,第六章、植物细胞制药,1、植物组织和细胞培养指在无菌的和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照、温度）下，研究植物的细胞组织和器官以及控制其生长发育的技术。2、植物无菌培养愈伤组织培养、悬浮培养、器官培养、胚胎培养。,.,3、植物细胞的形态和生理特性植物细胞的形态是多样的，有球状、多面体、纺锤形和柱状体等。理论上典型的未经分化的薄壁细胞是十四面体。,.,4、植物细胞培养的基本技术常用表面灭菌方法，常用灭菌剂：次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞。次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处理，时间一般为530分钟。氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间不宜长，以免杀死植物细胞，当其用于休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为0.1%，210分钟，种子皮较厚时可延长至20分钟以上。,.,5、用于植物细胞培养的无机盐可分无大量元素和微量元素，30毫克每升以上为大量元素，以下为微量元素。6、常用于植物细胞培养的激素有生长素、分裂素、赤霉素、脱落素、乙烯等。7、最适于植物细胞培养的发酵罐为气升式发酵罐，其根据气体湍流的方式不同可分为内升式发酵罐和外升式发酵罐。8、适合植物细胞培养的方式为连续液体培养（边进培养液边流出产物）。,.,第七章酶工程制药,.,药用酶：具有治疗和预防疾病功效的酶。酶法制药：在一定条件下，利用酶的催化作用将底物转化为药物的技术过程。诱导物分为三种：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的类似底物。酶法制药：在一定条件下，利用酶的催化作用，将底物转化为药物的技术过程。促进酶的生产：1.添加诱导物2.控制阻碍物的浓度3.添加表面活性剂4.添加刺激剂5.添加产物促进剂,.,酶的选择：1.根据欲生产的药物的结构特点，选择所需要的酶。2.根据底物的特点，选择所需要的酶。3.根据副产物的特点，选择所需要的酶。4.根据生产要求确定酶的使用方式。酶催化反应体系和反应条件的确定：1.根据底物、产物性质和生产要求选择催化反应体系。2.根据酶反应动力学性质确定催化反应条件。,.,添充床分为固定床和流化床流床：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。反应器的选择依据：1.根据固定化酶的形态选择2.根据底物的物理性质3.根据反应动力学特性选择4.根据外环境对酶的稳定性影响选择5.根据操作要求和反应器费用选择,.,第八章,赵盈盈,.,第一节,概念：发酵初级代谢产物次级代谢产物发酵制药：利用制药生物的繁殖，通过发酵，代谢产物合成药物，然后从中分离提取，精制纯化，获得药品的过程。发酵制药的基本流程图：样品采集微生物分离培养筛选鉴定前药化合物分离I新化合物纯化鉴定阳性结果I生产出发菌菌种鉴定与保藏,.,第二节,微生物发酵基本特征发酵前期发酵中期发酵后期微生物的生长动力学生长曲线生长速率比生长速率,.,第三节,菌种的选育（1）自然选育（2）诱变育种（3）杂交育种（4）分子定向育种(5)组合生物合成,菌种的保藏（1）低温斜面保藏（2）石蜡封存（3）沙土管保藏（4）冷冻干燥保藏（5）液氮保藏,.,第四节,前体：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到产物分子中，而自身的结构无多大的变化。促进剂：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物。培养基种类按用途：选择性鉴别性营养培养基按物理性质：固体半固体液体培养基按化学组成：合成半合成天然培养基按发酵过程中所处位置和作用：斜面或平板固体种子发酵和补料培养基,.,第五节,概念：杂菌污染消毒杀菌灭菌灭菌分类：化学物理培养基灭菌的操作方式分批灭菌：（间歇灭菌实罐灭菌）配制好的培养基输入发酵罐内，直接蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一段时间，再冷却至发酵要求的温度。灭菌过程：（1）加热升温（2）维持灭菌温度（3）冷却降温,.,操作过程：配料预热罐（70-90度）加热器（迅速升温130-140）维持冷却器空气除菌操作工艺：发酵对空气要求：空气流量空气质量工业制备大量空气的方法加热灭菌静电除菌介质过滤空气灭菌工艺流程空气-粗过滤-压缩机-储罐-冷却器-旋风分离器-丝网分离器-加热器-过滤器（空气过滤),.,第六节发酵培养技术,微生物发酵工艺过程三个阶段：种子制备、接种、发酵培养,.,8.6.1种子制备,种子的制备：种子的逐级扩大培养过程。获得一定数量和质量的纯种过程。,.,种子活化：将保存菌种接种在固体培养基上，在适宜条件下培养，恢复其固有生物特性。,确定种子级数的因素:1、菌种生长特性及菌体繁殖速度：生长快，少2、发酵罐的容积：越大，多3、产物的品种及生产规模：越大，多4、所选用工艺条件：有利于生长的工艺，少,.,发酵罐接种方式,单种法：一只种子罐接种一只发酵罐。双种法：两只种子罐接种一只发酵罐。倒种法：从发酵罐中取出一定量发酵液，接种到另一个发酵罐。,.,8.6.2发酵培养技术,1、固体表面培养技术：原始，最早采用。2、液体深层培养：主要的发酵培养技术高密度培养：菌体浓度（干重）50g/L以上的一种理想培养，发酵工艺目标和方向明确。优点：缩小发酵体积增加表达量成本低、生产率高,.,8.6.3发酵培养的操作方式,1、分批式操作；间歇式操作；不连续操作2、流加式操作，补料分批式操作3、半连续式操作，反复分批式或换液培养4、连续式操作，衡态操作5、灌流式操作，不断灌注新营养，取出条件培养基。,.,第七节发酵培养工艺控制,就地探头：pH，溶氧，温度，液位在线仪器：尾气分析仪离线仪器：基质、产物浓度生物学参数：菌体浓度，形态，杂菌物理参数：温度，压力，搅拌，粘度化学参数：基质浓度，pH，溶解氧，尾气，补料消泡,.,生物学检测主要的参数与控制：细胞形态、菌体浓度、发酵污染杂菌的检测与控制物理参数的检测与控制：1.温度的检测与控制:温度的选择原则、温度的控制方式2.压力的检测与控制3.搅拌的检测与控制化学参数的检测与控制:基质浓度、pH、溶解氧、废气,.,泡沫的形成原因、如何处理原因：菌体生长差、代谢速度慢、接种物质或种子未及时移种、发泡物质多、快速搅拌等泡沫控制：少加或缓加起沫物质、改变发酵条件（pH、升高温度、减少通气）、改变发酵工艺（分批投料）处理：机械和化学消泡,.,发酵终点的判断,最低成本获得最大生产能力的时间。1、原料和发酵成本的影响因素：产率：单位体积、单位时间内的产量得率：转化率，单位原料生产的产物量发酵系数：单位发酵周期内发酵体积生成产物体积产率：发酵单位除以总发酵时间,.,2、判断原则：1）经济原则:在最大生产率时，发酵总生产周期最短2)产品质量原则对后续分离纯化的影响：发酵时间太短，营养物质残留补料或消沫剂的其残留，以允许的残量为标准发酵时间太长，菌体自溶，改变发酵液性质增加分离纯化难度。对于抗生素，放罐前16小时停止补料和消沫。,.,第八节青霉素生产工艺,青霉素母核:6-氨基青霉烷酸概述作用机理：细胞壁合成中的肽多糖合成的第三阶段肽多糖的D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽类似物竞争性与转肽酶结合，使转肽酶不能催化多肽链之间的交联。生长中的细胞有效，静止细胞无效高效、安全的抗细菌感染药物,.,青霉素生产菌的生物学特性,青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速。,.,发酵培养下的生长过程及细胞学变化,第1期：分生孢子萌发，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,.,14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜种子。45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。第6期到来之前结束发酵。,.,青霉素生产流程框图,.,第九章药事法则重点,一、药品的特殊性1、专属性：处方药与非处方药2、两重性3、药品质量的重要性4、药品的时限性假药：药品所含成分与国家药品标准规定的成分不符；以非药品冒充药品或者或者以他种药品冒充此药品。,.,二、药品监督与管理的内容,1、药品生产管理GMP2、药品经营管理GSP3、医疗机构的药剂管理4、药品质量监督管理5、药品价格和广告管理,.,第二节药品、药学、药师,处方药：医疗用医药品，凭执业医师或执业助理医师处方才可调配、购买和使用的药品。非处方药：一般用医药品，不需执业医师或执业助理医师处方，消费者可自行判断、购买和使用的药品。处方药品种：一般为管制药、新药、毒副反应大的药物。适应症：诊断专属性强，病情严重。,.,非处方药(OTC)遵循的原则：应用安全，疗效确切，质量稳定，使用方便。品种：毒副作用小，疗效确切的药物，活性成分少，制剂多。适应症:小病，慢性病。处方药只能凭医生处方使用甲类非处方药可有执业医师指导使用乙类非处方药可有消费者自行判断、购买使用药品的质量特征:有效性、安全性、稳定性、均一性、经济性。,.,第三节生产管理与药品生产概述,生产：物品的制造或加工。在企业管理中，生产是企业多种职能中的一种，有狭义和广义的解释。侠义生产：指材料的加工和处理，有生产、开发的意思，也可使用制造或加工这些概念。,.,广义生产：是为形成其他物品和服务而有控制地投入物品和服务，如工业产品和手工业产品加工；银行、保险企业，审计提供的服务。药品生产的全过程可分为原料药生产阶段和将原料药制成一定剂型（供临床使用的制剂）的制剂生产阶段。,.,药品工业生产特点：1、原料辅料品种多，消耗大2、机械化、自动化程度要求高3、卫生要求严格4、药品生产的复杂性、综合性5、产品质量要求严格、品种规格多、更新换代快6、生产管理法制化,.,新药开发能力是制药企业核心竞争力；,新药品种储备是企业未来增长的保证。GMP是在药品生产全过程实施质量管理，保证生产出优质药品的一整套系统，科学的管理规范，是药品生产和质量管理的基本准则。药品生产质量管理规范,.,GMP的中心指导思想:任何药品的质量形成是生产出来的而不是检验出来的。因此，必须对影响药品生产质量的因素加强管理。,GMP认证的关键工序主要指精制、烘干、包装等工序。,.,批：在规定限度内，具有同一性质和质量，并在同一连续生产周期中生产出来的一定数量的药品为一批。每批药品均应编制生产批号。,批号:用于识别“批”的一组数字或字母加数字。用于追溯和审查该批药品的生产历史。,.,1抗体的结构以及其上与抗原的结合部位是什么?,抗体是一种免疫球蛋白,抗体有多肽链组成,其中两条大的链称为重链或者H链，两条轻的链叫轻链或L链，它们通过非共价键和二硫键连接成复合体，抗体分子的两条重链在一段彼此相互作用，在另一端分别与轻链相互作用，形成Y形结构。每一抗体分子含有两个抗原结合部位，它们位于Y形结构的两个臂的顶端，抗体分子是二价的而抗原分子是多价的。这里的价数是指抗原和抗体的结合部位数。每种免疫球蛋白的L链和H链都含有可变区（V）和恒定区（C）。L链和H链得可变区都在链的N末端区域，在L和H练得V区内有所谓的高变区，他负责抗体分子对抗原的识别，是真正的抗原结合部位。,.,2什么情况下连接酶不能起连接作用？,需要在有一个磷酸基的情况下才能连接，反之则不能。只有一条DNA链的3|撇末端具有一个游离的羟基。而在另一条链的5撇末端具当3撇的羟基和5撇的磷酸基是彼此相邻的，并且是各自位于与互补链上之互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，才能将他们连接成磷酸二脂键，反之则不行。不能够连接两条单链的DNA分子只能封闭双螺旋DNA分子上失去一个