机能实验学完整版

尼古丁抗雌激素作用研究,医学检验1002班设计参与者:张志慧魏冬梅齐天琪谷怡珊冯智才,一.【研究背景及立论依据】,雌激素是一类有广泛生物活性的甾体化合物,它有促进和维持生殖器官和副性征的生理作用,可应用临床治疗疾病。雌激素对不仅细胞增殖起促进作用，还能诱导乳腺癌和子宫内膜癌的发生及发展。因此如何拮抗或减弱雌激素的作用以治疗雌激素依赖性疾病成为研究热点，并具有重要的临床意义。,尼古丁又叫烟碱，是一种吡啶族生物碱，它可以通过呼吸道、鼻粘膜、皮肤迅速吸收入人体，并通过尿液、胆汁、唾液、胃液、汗液和乳汁排泄。尼古丁作为烟中碱类的主要成分，具有拮抗雌激素作用。,二.【设计思路】,本实验通过对家兔行双侧去卵巢手术后阴性对照组、尼古丁组和阳性对照组，采用放射性配基结合分析法测定各组放射性，通过各浓度组放射活性与阴性对照组比较探讨尼古丁是否通过竞争结合ER途径显示抗雌激素样作用,为进一步研究作用机制提供理论依据。,技术路线,三.【实验内容】,实验步骤,观察指标,预期结果,卵巢切除术,子宫雌激素受体(ER)抽提液的制备,测定子宫雌激素受体(ER)抽提液蛋白含量,尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验,统计学处理,1实验步骤,1）卵巢切除术,实验动物适应性饲养,1w,双侧卵巢摘除术,处死,阴道脱落细胞学检查,取出子宫剥离脂肪,冻存于液氮,1w,2)子宫雌激素受体(ER)抽提液的制备,冻存子宫快速剪碎,加入抽提缓冲液,匀浆,差速离心，去沉淀,上清液即为ER胞浆液,每管按编号加入试剂(见表一）,静置3分钟,混匀,以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，,作图,另取试管,样品液,考马斯亮蓝染液,静置3分钟，595nm比色,分析,3)测定子宫雌激素受体（ER）抽提液的制备,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线测定表,尼古丁反应体系,阳性对照体系,阴性对照体系,加胞浆液及3H-E2,16小时,加DCC，混匀,冰浴、离心,FJ-2101G计数放射活性,4)尼古丁与受体结合亲和力竞争性取代试验,5)统计学处理,SAS12.0软件,单因素方差分析及Speaman相关分析,Origin软件,3H-E2特异性结合指数浓度图,2,观察指标,3预期结果,(1)随着尼古丁浓度的升高,其与家兔子宫胞浆ER结合的3H-E2有明显降低。且尼古丁反应体系的3H-E2特异结合指数(%)与阳性对照E2反应体系中的变化趋势趋于一致。说明，尼古丁可以竞争性结合激素受体。尼古丁各浓度组放射活性与阴性对照组比较,差异无统计学意义。,随着尼古丁浓度的升高,其与家兔子宫胞浆ER结合的3H-E2没有明显降低。即尼古丁反应体系的3H-E2特异结合指数(%)几乎不随尼古丁浓度的改变而变化，而阳性对照E2反应体系中的特异性结合指数(%)随E2浓度升高，明显降低。说明，尼古丁可能与雌激素受体结合，但其作用的配体位点与雌激素明显不同。两者之间不存在竞争结合；尼古丁可能不与雌激素受体结合，而是通过其他未知途径干扰雌激素和雌激素受体的结合过程。尼古丁各浓度组放射活性与阴性对照组比较,差异无统计学意义。,四.【实验材料】,1受试物与主要试剂:95纯净的烟碱（尼古丁）;6,7-3H雌二醇(3H-E2),48Ci/mmol;17-雌二醇(estradiol,E2);2,5-二甲基恶唑(PPO);1,4-双-2-15-苯基恶唑-苯(POPOP);,（1）受试物配制:尼古丁溶于无水乙醇,配制成310-3mol/L母液,置-20保存。,（2）实验溶液的配制:雌激素受体抽提缓冲液:Tris10mmol/L,EDTA1mmol/L,用1mol/LHCl调pH至7.4,体积分数为10%的甘油,4保存,临用前每100ml缓冲液加43ml巯基乙醇。活性炭-葡聚糖(DCC)悬液:Tris10mmol/L,DextronT-700.025g/L,用1moL/LHCl调pH至8.0,4保存。临用时每100ml加入0.25g活性炭,充分搅拌。闪烁液:PPO5.5g,POPOP0.07g,溶于1L二甲苯。,2实验动物:采用体重3.0-3.5公斤的新西兰种雌兔（家兔）,去卵巢一周后取子宫,-80保存,一周内测定。整个实验过程中,动物自由摄食和饮水,室温2023,相对湿度65%-75%,12h/12h明暗周期。,五.【创新性与可行性】,1创新性（1）立题创新以根据现实生活中普遍存在的二手烟为立足点，联想二手烟中的主要成分尼古丁对于人体的影响。本组成员通过查找各类相关文献，发现与我们惯性思维所认为的致癌有毒的尼古丁有差异，研究表明尼古丁不一定是可怕的致癌凶手，其本身不引起肿瘤，相反，尼古丁在人体中存在抗雌激素的作用。尼古丁对于由雌激素诱导的疾病如子宫内膜异位症、子宫肌瘤及乳腺纤维腺瘤等具有临床治疗意义。,（2）方法创新本实验采用相对简单、易于理解的放射性配基结合分析法作为实验骨架技术。通过控制单因素变量，绘制竞争性结合曲线对比实验组和对照组数据结果，直观判断实验结果。避免过于复杂误差较大的实验设计方法。,（3）实验结果临床意义的创新进一步探究尼古丁对雌激素竞争性抑制机制，加深人们尼古丁的认识，通过研究尼古丁及其类似物对靶组织局部抗雌激素作用的机制，为雌激素依赖性疾病提供新的治疗策略。,2可行性实验选用以往常规的家兔作为实验对象，实验对象熟悉易得，既增加了同学们的动手操作能力，又可探究本设计所要研究的问题；