医学论文-1,25-二羟维生素D3对链脲菌素诱导的小鼠1型糖尿病预防作用及机制探讨.doc

医学论文-1,25-二羟维生素D3对链脲菌素诱导的小鼠1型糖尿病预防作用及机制探讨【摘要】 目的 1,25-二羟维生素D31,25-(OH)2D3对连续多次小剂量链脲菌素（the multiple low dose streptozotocin,MLDS）诱导的1型糖尿病小鼠的预防作用及其机制初探。方法 MLDS腹腔注射制备1型糖尿病小鼠模型，以血糖水平持续高于16.7mmol/L为成模标准。实验共分三组，分别为正常对照组、糖尿病组、预防组。采用便携式血糖仪监测各组血糖水平；放射免疫法检测各组血清胰岛素含量；免疫组化法检测各组胰岛细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-xL表达。结果 MLDS诱发的1型糖尿病模型在第四周基本建成。MLDS使小鼠血糖升高，血清胰岛素含量下降，Bax上调、Bcl-xL下调。预防组血糖水平下降，血清胰岛素升高，Bax下调、Bcl-xL上调，糖尿病发病率下降，与糖尿病组比较有显著差异(P0.05)。结论 1,25-(OH)2D3可有效预防MLDS诱导的1型糖尿病的发生，其效应可能与1,25-(OH)2D3调节Bax和Bcl-xL蛋白表达平衡有关。 【关键词】 1,25-二羟维生素D3；链脲菌素；1型糖尿病；Bax；Bcl-xL Abstract：Objective To investigate the prevention and the mechanism of 1,25-dihydroxyvitamin D3 to type 1 diabetes by streptozotocin-induced in KM mice.Methods Experimental type 1 diabetes mice model with the blood glucose level which was consistently higher than 16.7mmol/L were produced by intraperitoneal injection of MLDS.There are three groups in this studay,which were normal control group,diabetes group,and 1,25-dihydroxyvitamin D3 prevention group.Blood glucose level was monitored using a one-touch blood glucose meter.Radioimmunnity analysis was used to detect the serum insulin level.The protein expression level of bax and bcl-xL in islets were detected with immunohistochemical technique.Results MLDS-induced type 1 diabetes mice model was finished in the fourth week.Blood glucose level and bax protein expression level increased after the treatment of MLDS,but serum insulin level and bcl-xL protein expression level decreased.1,25-dihydroxyvitamin D3 prevented diabetes induced by MLDS in KM mice.The blood glucose level decreased,the serum insulin level increased.Bcl-xL protein expression was up regulated,bax protein expression was down regulated and the incidence of diabetes decreased significantly in 1,25-dihydroxyvitamin D3 prevention group compared with the control.Conclusion 1,25-dihydroxyvitamin D3 treatment could prevent type 1 diabetes through regulating the protein expression of bax and bcl-xL. Key words:1,25-dihydroxyvitamin D3；Streptozotocin；Type 1 diabetes mellitus；Bax；Bcl-xL 1型糖尿病是由T细胞介导的胰岛细胞选择性破坏的自身免疫性疾病。遗传易感因素与环境因素相互作用致使免疫调节失衡，细胞免疫耐受丧失而遭受免疫攻击。大量研究发现细胞凋亡过度可能启动细胞自身免疫过程。细胞凋亡与Bcl-2原癌基因家族关系密切，Bcl-2家族分为两大类型：促凋亡基因，主要包括Bax、Bcl-xS、Bid和Bad；抑凋亡基因，主要包括Bcl-2和Bcl-xL。 1,25-(OH)2D3是维生素D3在体内的高度活性形式，其经典的生物学作用是维持钙、磷代谢平衡。近年研究发现1,25-(OH)2D3与1型糖尿病关系密切。1,25-(OH)2D3可能通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达和抑制胰岛非特异性炎症而延缓或阻止NOD鼠自身免疫性糖尿病的发生，但1,25-(OH)2D3对Bcl-2家族中的Bcl-xL在胰岛细胞表达的影响尚不清楚。 1 材料与方法 1.1 材料 STZ、1,25-(OH)2D3（sigma）；血糖试纸（美国强生公司）；胰岛素放免试剂盒（中国原子能放射研究所）；兔多克隆抗体Bax（Santa）、Bcl-xL（武汉博士德）；免疫组化SP-9003试剂盒、DAB（北京中山生物技术公司）。动物用雄性昆明小鼠（重庆医科大学实验动物中心提供），体重2025g。 1.2 方法 模型的建立 随机选取40只体重在2025g的健康雄性昆明小鼠，连续5d腹腔注射STZ（40 mgkg-1），分别于注射STZ的第1、2、3、4、6周末各测一次血糖，以血糖水平持续高于16.7 mmol/L为判断成模的标准。造模期间死亡动物不计入统计范围。 1.2.1 动物分组 正常对照组，连续5d腹腔注射与糖尿病组等容量柠檬酸盐缓冲液；糖尿病组，成模小鼠隔日腹腔注射与1,25-(OH)2D3组等容量花生油，共15次；预防组，先隔日腹腔注射1,25-(OH)2D3（5gkg-1），共15次，然后再连续5d腹腔注射STZ（40 mgkg-1）。 1.2.2 样本采集与处理 各组小鼠断尾取血便携式血糖仪检测血糖水平；实验结束后采集血清放射免疫法检测血清胰岛素水平，采集胰腺标本免疫组化法观察胰岛细胞Bax和Bcl-xL蛋白表达水平。 1.3 统计学分析 SPSS10.0软件处理。结果以s表示。同组内处理前后比较用配对t检验。组间比较用完全随机设计的方差分析，若结果有意义再进行多个样本均数间比较的SNK-q检验（Bax、Bcl-xL阳性率经平方根转化后再进行统计分析）。糖尿病发病率用fisher确切概率法。P0.05表示差异有显著性，P0.01表示差异有极显著性。 2 结果 2.1 各组血糖水平观察 预防组和糖尿病组注射STZ后血糖水平均增高（P0.01)。但预防组血糖水平明显低于糖尿病组（P0.01)，见表1。表1 1,25-(OH)2D3对各组小鼠血糖水平影响 2.2 1,25-(OH)2D3对小鼠糖尿病发病率的影响 注射STZ后1，2，3周预防组发病率均低于糖尿病组，但无统计学意义。第4、6周预防组发病率明显低于糖尿病组，有显著性差异(P0.01)，见表2。 2.3 血清胰岛素水平 与正常对照组（12.133.11mU/ml）相比，糖尿病组血清胰岛素含量（3.861.65mU/ml）显著下降（P0.01)；预防组血清胰岛素含量（8.863.99mU/ml）虽低于正常对照组（P0.01），但明显高于糖尿病组（P0.01)。 2.4 Bax、Bcl-xL在小鼠胰岛细胞中的表达 胰岛细胞Bax和Bcl-xL阳性表达率见表3。二者均在胞浆表达。糖尿病组Bax（封3 Fig.3）高表达，Bcl-xL（封3 Fig.4）低表达，与正常对照组（封3 Fig.1、Fig.2）相比有显著性差异（P0.05）。预防组Bax（封3 Fig.5）低表达，Bcl-xL（封3 Fig.6）高表达，与糖尿病组比较差异显著（P0.05)。表2 1,25-(OH)2D3对MLDS诱导小鼠糖尿病发病率的影响 表3 Bax、Bcl-xL在小鼠胰岛细胞中的表达 3 讨论 3.1 STZ致糖尿病的可能机制 STZ是由致癌物质MNU衍生的一种2-脱氧-右旋-葡萄糖，选择性破坏细胞，它可以直接导致DNA的甲基化；还可以通过产生活性氧和NO发挥间接损伤作用1。 1型糖尿病是由T细胞介导的自身免疫性疾病，遗传易感因素与环境因素相互作用致使免疫调节失衡。胰岛细胞凋亡过度可能启动自身免疫，导致细胞免疫耐受丧失而遭受免疫攻击，发生1型糖尿病。我们在实验中发现，连续多次小剂量STZ注射可使胰岛细胞高表达Bax，低表达Bcl-xL。Bax和Bcl-xL为Bcl-2基因家族重要成员，该家族成员与细胞凋亡的关系密切。Bax自身可以二聚化形成同源二聚体或与Bcl-xL形成异源二聚体，当所有细胞中50%Bax与Bcl-xL形成异源二聚体时可抵抗凋亡的发生，而当80%Bax自身形成同源二聚体时细胞发生凋亡。Bcl-xL（Bcl-x long）是由Bcl-x基因转录后经过两种不同的剪切方式翻译后形成的，其翻译产物还包括Bcl-xS（Bcl-x short），Bcl-xL表现为抗凋亡作用，Bcl-xS表现为促凋亡作用。TNF处理的细胞钙结合蛋白表达下调，细胞内钙离子浓度升高，进而促发细胞凋亡，在此过程中Bcl-2下调，Bax上调2。T3和hGH可以通过提高Bcl-xL/Bax表达比例对抗IFN-、TNF-、IL-1和STZ的细胞毒性作用3、4。小鼠胰岛细胞过表达Bcl-xL超过正常3倍时可抵抗多种致凋亡因素的细胞损伤效应5，说明Bax和Bcl-xL在胰岛细胞凋亡中确实起着非常关键的作用。因此我们认为连续多次小剂量STZ注射可能部分通过增强Bax和抑制Bcl-xL蛋白表达而促进胰岛细胞凋亡，诱发细胞的自身免疫，进而促进型糖尿病的发生。 3.2 1,25-(OH)2D3对1型糖尿病的预防作用 1,25-(OH)2D3是维生素D3在体内的高度活性形式，通过与体内特异性受体（VDR）结合发挥生物效应，VDR分布非常广泛，胰岛细胞上也有VDR分布，提示维生素D对机体具有广泛作用，经典生物学作用是维持机体钙磷代谢平衡。近年大量研究发现1,25-(OH)2D3对免疫系统也有调节作用。糖尿病流行病学国际合作调查22个国家的5千万名年龄小于15岁的儿童发现，年平均温度较低地区日照短，人群血清1,25-(OH)2D3水平较低，1型糖尿病发病风险明显增加。新诊断的1型糖尿病患者血清1,25-(OH)2D3和25-(OH)1D3水平明显低于同年龄非糖尿病患者，且1,25-(OH)2D3水平与患者代谢控制状态、年龄、性别、季节无相关性6。饮食中缺乏维生素D也与1型糖尿病风险度增加相关7。规律的补充维生素D（2 000 U/d）时，1型糖尿病的风险减少约808。但关于维生素D3通过何种机制发挥防治1型糖尿病的作用还未完全搞清楚。 我们发现预防性应用1,25-(OH)2D3后可部分纠正由STZ诱导的胰岛细胞Bax和Bcl-xL蛋白表达失衡，下调Bax蛋白表达水平、上调Bcl-xL蛋白表达水平，降低Bax/Bcl-xL比例，大大减轻细胞损伤。国内研究也发现，1,25-(OH)2D3可减轻NOD鼠胰岛炎，并通过上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，减轻细胞凋亡9，延缓或减轻由凋亡启动的自身免疫。同时，将编码Bax的cDNA与编码GADA的质粒疫苗融合植入胰岛细胞可预防1型糖尿病的发生，此疫苗可诱导CD4+CD25-的体外免疫抑制效应，通过细胞接触诱发免疫抑制对抗机体对胰岛细胞的免疫攻击10。因此，我们有理由推测，1,25-(OH)2D3可能通过调节Bax和Bcl-xL蛋白表达对抗STZ致细胞凋亡作用，进而阻断凋亡启动的自身免疫。很多学者认为凋亡可能是胰岛移植过程中导致细胞丢失的主要方式11，提示胰岛细胞移植前，用1,25-(OH)2D3预处理可能有助于减轻细胞凋亡，提高移植成功率，对有效治疗1型糖尿病有一定意义。 综上所述，1,25-(OH)2D3可有效预防连续多次小剂量STZ诱导的小鼠1型糖尿病的发生。1,25-(OH)2D3及其类似物作为潜在的预防1型糖尿病的药物，可能具有广泛的临床应用前景。【参考文献】 1Bedoya FJ,Solano F,Lucas M.N-Monomethyl-arginine and Nicotinamide Prevent Streptozotocin-induced Double Strand DNA Break Formation in Pancreatic Rat IsletsJ.Experientia,1996,52(4):344-347.2Parkash J,Chaudhry MA,Photen WB.Tumor Necrosis Factor-alpha-induced Changes in Insulin-producing Beta-cellsJ.Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol,2005,286(2):982-993.3Verga Falzacappa C,Panacchia L,Bucci B,et al.3,5,3-triiodthyronine(T3)Is a Survival Factor for Pancreatic Beta-cells Undergoing ApoptosisJ.J Cell Physiol,2006,206(2):309-321.4Jensen J,Galsgaard ED,Karlaen AE,et al.STAT5 Activation by Human GH Protects Insulin-producing Cells against Interlekin-1Beta,Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha-induced Apoptosis Independent of Nitric Oxide ProductionJ.J Endocrinol,2005,187(1):25-36.5Zhou YP,Pena JC,Roe MW,et al.Overexpression of Bcl-xL in Cells Prevents Cell Death but Impairs Mitochondrial Signal for Insulin SecretionJ.Am J Physiol Endocrinol Metab,2000,278(2):E340-351.6Pozzilli P,Manfrini S,Grino A,et al.Low Levels of 25-hydroxyvitamin D3 and 1,25-dihydroxyvitamin D3 in Patients with Newly Diagnosed Type 1 DiabetesJ.Horm Metab Res,2005,37(11