【毕业学位论文】（Word原稿）谷子Msch基因的分子标记及psbA基因的鉴定作物遗传育种硕士论文

密级 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 谷子 因的 分子 标记及 因 的鉴定 of of 摘 要 谷子是我国主要杂粮作物之一， 营养平衡、丰富，秸秆又可做优质饲草 ，且具有耐旱、耐瘠薄等特点， 是干旱少雨地区的首选作物。 随着西部大开发战略的实施，种植业结构调 整，谷子的生产呈现出新的发展势头。近年来，我国在杂种优势的利用及谷子抗除草剂等育种方面取得了多方面显著的成绩， 这就为在分子水平上研究其雄性不育与抗除草剂特性的遗传机制奠定了扎实的材料基础。而从分子水平解析谷子雄性不育与抗除草剂特性的遗传机制又将促进其遗传育种研究整体水平的提高。 本研究首次运用 术对谷子显性雄性不育基因 验选用 谷子基因组双酶切，用父本、母本、可育池和不育池对 400 对引物组合进行筛选，共有 4 对引物组合 37、 42、 52 和 52 在亲本及可育池和不育池之间扩增出稳定的多态性条带。然后，用 150 株 1 1 群体的单株进一步对与雄性不育连锁的 4 个初选标记进行单株验证，结果发现有 2 个标记（ 42 和 52）与不育基因表现出松散的连锁关系，予以剔除。而与不育基因紧密连锁的 2 个标记（ 37 和 52），分别扩出 224 208片段。用 件对实验数据进行处理、计算，结果显示 2 个标记 37 和 52 与不育基因 遗传距离分别为 2.1 是分布于不育基因的同一侧的 记，两个标记间的遗传距离为 两个分子标记的确定，为进行分子标记选择育种、图位克隆、染色体定位等奠定了基础。在此基础上，我们将与不育基因 锁的 2 个 记转化为 记，这样就可以更加快速的鉴定转育后代，加速不育系的选育进程，使之在分子标记辅助育种中更为经济、快捷、实用。 另外，本实验室用花粉作载体将源于近缘野生种细胞质的抗除草剂“阿特拉津”基因转移到谷子中，已获得成功。本研究对谷子 2 个抗阿特拉津品种（通过花粉转入的 细胞质抗除草剂 “阿特拉津 ”基因 ）和 3 个感阿特拉津品种（普通栽培种）的 因的克隆，并对克隆片段进行测序比较，发现抗阿特拉津谷子 因编码区的第 790 个碱基由 A 突变成 G，从而导致 因编码的第 264位氨基酸密码子由 成了 应的氨基酸由丝氨酸变为苷氨酸。从分子水平上进一步证明了 细胞质抗除草剂 “阿特拉津 ”基因 是可以通过花粉进行转移的。 关键词： 谷子，显性雄性不育， 因 I is of It be It is to on of is a in In of in of on s at In we to NA of A 00 to 37, 42, 52 35/in 50 of :1 42 21/to 37 35/to 24 bp 08 bp .0 17/35/to .1 cM .4 on of to to on be by to In of of of 90th , 64th of er ey 录 第一章 前 言 . 1 1 “ 谷子核不育的研究进展 . 1 ” 不育系的发现及细胞学研究 . 1 “ ” 不育材料的应用 . 3 2 主要分子标记技术 . 3 . 4 . 4 . 5 原理 . 6 3 植物雄性不育相关基因的标记定位研究 . 7 . 7 . 7 . 8 4 分子标记技术在谷子上的应用 . 10 5 谷子抗阿特拉津 (因 . 11 . 11 . 12 除草剂基因主要 有 3种类型 . 12 阿特拉津基因的作用机理 . 12 . 13 5.4 . 13 . 13 . 15 第二章 谷子显性不育基因 记 及 记的转化 . 16 1 材料与方法 . 16 验材料 . 16 验方法 . 16 子基因组 . 16 . 17 丙烯酰胺胶中差异片段的回收 . 21 . 21 列测定与分析 . 21 . 21 V 2 结果与分析 . 22 间育性鉴定 . 22 度和质量的检测 . 23 不育基因 . 23 建不育、可育池 . 23 选显性不育基因连锁的 记 . 23 1 1群体对筛选到的标记进行验证 . 24 据处理 . 27 . 27 育基因 增及测序 . 27 记转化为 . 28 论 . 29 第 三章 谷子叶绿体阿特拉津抗、感基因 克隆 . 31 1 材料和方法 . 31 料 . 31 法 . 31 绿体 提取 . 31 物 . 33 因组 . 33 . 34 质粒载体中进行 . 34 裂解法少量提取质粒 . 36 裂解法大量提取质粒 . 37 列分析 . 37 列比对和系统发育树的构建 . 37 2. 结果与分析 . 37 因组 质量与浓度检测 . 37 2.2 . 37 抗、感谷子 . 38 子 基酸序列的比较 . 40 2.5 . 40 3 讨论 . 42 第四章 结 论 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 51 缩 略 词 d: B: g: b : l: D: : g: l: 第一章 前 言 1 第一章 前 言 谷子 (又称小米，为禾本科 ( 狗尾草属 (的 草本植物，是我国北方一些地区的重要粮食作物 。 谷子原产于我国 ， 是世界栽培历史最悠久的作物之一 ， 也是我国最古老的栽培植物之一 ， 是我国 的 主要杂粮作物 （李荫梅， 1997）。 目前，谷子在世界上分布很广 ， 从南纬 40度至北纬 6有种植。 我国谷子种植面积与总产均居 世界首 位 ， 其次为印度 、朝鲜 、 日本 、 埃及 、 俄罗斯 、 阿根廷等国家 。 谷子属于严格的自花 授粉作物，花器小，人工杂交难度大，且遗传基础稳定，一些数量性状的改造需要几次的复交，需要几个世代才可以完成，因此限制了谷子的育种进程。 杂种优势 的 利用是增强谷子生产潜力 ， 大幅度提高谷子产量 的 有效途径之一 （王玉文等， 2003；李会霞等， 2002）。杂种优势是自然界中普遍存在的一种生物现象 。 两个遗传性不同的品种进行杂交 ， 其杂交一代表现出比双亲更强的生活力、生长势、适应性、抗逆性和丰产性，这种杂交一代超过双亲的现象，就是杂种优势。生产中种植杂种一代以达到增产的目的，称为杂种优势利用。 作物雄性不育的选育是杂种优势利用 的关键技术，创造雄性不育系和恢复系已经成为谷子育种的关键技术。目前，国外对谷子杂种优势的利用还未见报道，而我国谷子杂种优势的利用研究已取得了多项突破性进展，先后发现与利用了高度雄性不育、核基因互作型雄性不育和谷子光（温）敏核不育材料等，并且利用培育出的优良不育系配制的杂交种已在生产实践中显示出了很好的应用价值，表明利用雄性不育是实现谷子杂种优势最经济、有效的途径之一（王天宇等， 1993；王天宇等， 1994；赵治海等， 1996；崔文生等， 1979；王玉文等， 2003）。 1 “ ”谷子 核 不育的研究进展 ”不育系 的发现及细胞学研究 雄性不育 (指雄性器官 (花药、花粉或雄配子体 )发育不良，失去生殖功能，导致不育的特性 雄性不育性在植物界普遍存在 据 988)报道，已经在 43 科 162 属 617 个物种及种间杂种中发现了雄性不育，其中包括玉米、水稻、小麦、 谷子、 高梁、油莱、棉花等主要农作物 从 20 世纪以来，雄性不育的遗传理论也不断发展，特别是近代兴起的分子生物学理论和技术，把对植物雄性不育遗传机制的研究推进到了一个更深的领域 (李泽福， 2000) 细胞核雄性不育 （ 由核基因控制的自然界最常见的雄性不育现象，人们已经在玉米、棉花、谷子、水稻、大豆、小麦、油菜和大白菜等许多作物上发现和诱导出这种雄性不育类型。在核不育材料中多数是由隐性基因控制的，由显性基因控制的雄性不育现象，国内外曾在棉花、莴苣、红胡麻草、马铃薯、小麦、亚麻等少数植物中发现过（ et 1964； et 1963； et 1910； 邓景扬等， 1980）。谷子显性核基因互作型雄性不育是胡洪凯等（ 1978） 从“澳大利亚谷吐鲁番谷”杂交后代中发现一份不育材料“ 78182”，后来又经过多年的回交、测交研究，证实该材料的不育性受一对核显性基因控制（ 胡洪凯等，1986；胡洪凯等 ， 1993）， 并定名为赤峰显性核不育，简称 “ ” 核不育， 第一章 前 言 2 时，经过大量的测配从它的姊妹系中发现了恢复源材料 181181带的显性上位基因可以抑制杂交种中显性不育基因的表达，使育性恢复正常（ 胡洪凯等， 1993）。 刁现民等（ 1991）对 “ ” 不育株花药进行细致的观察，发现 1 1群体中的杂合雄性不育株的花 药发育从外部形态上，同正常可育株基本一致，花药的形状、大小、颜色均相同。但开花时花药伸出后不开裂，花粉不能散出，剖开花药授粉，花粉具有受精能力。纯合不育株的花药在发育早期，同正常可育株基本一致。开花期肉眼观察花药的大小和形状也接近正常，在放大镜和解剖镜下比较观察，纯合不育株的多数花药较为瘦小，药室不饱满，部分花药同正常可育株差别不明显。纯合不育株花药伸出后不开裂，两天后有桔黄色变为黑褐色。进一步切片研究发现药隔维管束异常是造成 “ ” 纯合不育株药室内细胞败育的原因；而杂合不育株的药隔是正常的，其药室内细胞 也不发生败育（刁现民， 1988；刁现民， 1991）。 合不育 ) 恢复源 (181 (海南 ) (通过 转育 ) (海南 ) (海南 ) (海南 ) (海南 ) 1/4 1/4 2/4 (赤 峰 ) (全不育 ) (3 不育 ： 1 可育 ) (全不育 ) (海南 ) (1 不育 ： 1 可育 ) 淘 汰 ) 纯合上位系 (100%可育 ) 合一型系 纯合可育系 (100%不育 ) (100%可育 ) 合 一 型系 纯合上位系 (100%不育 ) (100%可育 ) f_/交种 (全可育 ) 图 ”显性核不育在杂种优势上的应用及选育程序 H of in （胡洪凯， 1993） 第一章 前 言 3 “ ”不育 材料的应用 “ ” 不育株可以提供一些花粉，这样就可以通过不育株的花粉与各种谷子普通品种杂交，观察它们对这个不育基因的反应，测定普通品种中可能存在的不同细胞质，从而为研究细胞质提供一个不可多得的工具。 “ ” 不育株雌蕊发育正常，柱头外露 自由授粉结实率高，它在进行轮回选择、群体改良、复合杂交的育种程序中有广泛的应用前景。 由于 “ ” 不育材料是受两对显性连锁基因上位互作控制着育性的基因互作型显性核不育。正是因为有上位恢复基因的存在，从而解决了杂种优势利用中的育性恢复问题。同时，它的的杂合不育株和纯合不育株花药内有部分正常可育花粉，在北方谷子产区花药始终不开裂不散粉，自交不结实；但在特定短日照的生态条件下（如冬季在低纬度的海南三亚、通什和广东湛江等地），则花药部分开裂，能产生 自交种子，可以获得纯合的全不育群体（ 胡洪凯等 ， 1993；王天宇等， 1994）。基于这些特点，胡洪凯等人建立起一套特殊的“三系”制种体系（如图 巧妙地解决了杂种优势利用中不育系繁种、育性恢复等问题，为作物杂种优势的利用开辟了一条新路（刘秉华， 2001），也进一步丰富了杂种优势利用的理论内容（ 国家自然科学奖公告， 1999） 。 2 主要分子标记技术 20 世纪 80 年代以来，以 态性为基础的分子标记技术蓬勃发展起来。 子标记 (以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是 用的分子标记特征比较 of 特性 布 普遍 普遍 普遍 普遍 可靠性 高 中等 高 高 重复性 高 中等 高 高 遗传性 共显性 显性 显性或共显性 共显性 多态性 中等 高 非常高 高 求 2 30 100000 100射形 一般有 无 有或无 无 技术难度 中等 简单 中等 简单 样品生产率 中低 高 非常高 高 时间因素 长 快 中等 快 探 针类型 低拷贝 隆 随机序列 特异 列 特异 复 序列 探测部分 低拷贝编码区 域 整个基因组 整个基因组 整个基因组 探测位点 10-5 第一章 前 言 4 水平遗传多态性的直接反映。目前分子标记已经发展到 10 多 个， 主要有限制性片段长度多态性(随机扩增多态性 扩增片段长度多态性 (简单重复多态性 (单链构象多态性 (随机引物 序列标签位点 (转录内间区 (微卫星 特征性片段扩增区域 (。最常用的分子标记技术是 术，表 出了它们的标记特点。 术的发展及其基本原理 1993 年由荷兰科学家 展起来的一种检测 态性的新方法 ， 术是在 基础上发展起来的 (et 1993； et 1995)。其既克服了 多态性低和 稳定性不好的缺点，又具有 可靠性和 认为 是迄今为止最有效的分子标记（ et 1996； et 1995）。原理是基于对植物基因组总 酶切经 增后的限制片段进行选择。具体是植物基因组 限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定双链接头 (接在这些 段的两端，形成一个带接头的特异片段，作为 增的模板。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点。 末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区， 这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增 ， 扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。 术的关键 程包括模板制备、片段扩增和凝胶分析这 3 个主要步骤。其中模板 备、引物选择以及引物标记是 术的关键所在。 酶的选择 进行 析时，一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组 行酶切，一种为低频剪切酶 (识别位点为六碱基的 另一种为高频剪切酶 (识别位点为四碱基的 利用双酶切 可产生长度适宜的扩增反应模版，在凝胶上产生大小适宜于分离的片段，不同的内切酶组合及选择性碱基的数目和种类可灵活调整片段的数目，从而产生不同 的 。常用六碱基识别位点的低频剪切酶有 、 、 、 、 ， 最常用的四碱基识别位点高频剪切酶 (et 1998； 1998)。 引物和接头 物包括 3 部分，在 5端以 G 开头的核心序列 (限制性内切酶专化序列 ( 3端的带有选择性碱基的黏性末端 (et 1995)。 头是巧妙设计的长度为 14 18 个核苷酸的人工双链片断，包括两个部分：核心序列和酶切黏性末端，接头的碱基缺口恰好与酶切 断末端互补配对。设计接头时需要考虑： (1)限制性片段与对应的接头连接应保证原限制性内切酶位点不得恢复，通常将接头所含识别序列置换一个碱基，如将 识别序列 5 第一章 前 言 5 中 5端的 C 替换为 A，连接后 位点就不能再被 消化； (2)防止人工接头的自身连接，解决办法是在接头 5端设计 3 个碱基的突出。人工合成接头时，两条单链寡聚核苷酸需分别合成，然后再通过变性、退火使其形成双链结构。 扩增反应 酶切片段一般经过 2 次 增，第 1 次 扩增 (应，预扩增引物中只含有 +1 或 +0 个选择性核苷酸，预扩增反应条件为： 94 30s， 60 30s， 72 1扩增反应产物用超纯水或 释 20 倍后用作第 2 次扩增反应 (即选择性扩增反应， 模板，第 2 次扩增一般用 的选择性引物进行扩增。 术分两次进行嵌套扩增反应能有效减少“ 景污染，扩增结果更清晰、更稳定、重复性更好。 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 根据陶爱林等的研究，凝胶中 浓度控制在 在功率不变的情况下能够提高单位距离上的电压降低通过的电流，使一些原来弥散的条带变得清晰 (陶爱林等， 2003)。在实验中发现电泳时胶板温度对胶板质量影响很大，在 40左右 (感觉温手 )跑出的胶带纹清晰，过高或过低的温度都会使带纹发虚。在大功率、 超高电压条件下电泳很容易使胶板由于散热不佳导致温度过高，轻则谱带发虚、 尾明显而影响胶板的分辨率，重则直接损坏制胶的玻璃基板。充分的预电泳对提高胶的分辨率也有帮助， 80W 恒功率预电泳 1h 后 (低温环境中电泳防止胶版温度过高 )，正式电泳时电流与电压波动幅度明显降低趋于恒定。电泳时间以二甲苯氰电泳至玻璃板基部 5右停止电泳为宜，或溴酚蓝电泳出玻板后约 1h 停止电泳， 10%乙酸固定后进行银染。银染具体步骤，参考分子克隆实验指南等方法进行 (张峰等， 1999；萨姆布鲁克等 ， 1992)。 术的特点 理论上， 以产生的标记数目是无限的；扩增效率高，多态带比例高； 记呈典型的孟德尔方式遗传，可作为物理图谱和遗传图谱的联系桥梁，用于构建基因组的高密度连锁图谱； 记稳定可靠，不受基因组来源和复杂度的影响，没有种属特异性； 模板浓度不敏感，允许一定程度的共扩增。经 研究发现，在底物浓度相差 1000 倍的范围内，术得到结果基本一致； 应中引物会消耗殆尽，过多的扩增循环是多余的。 与其它分子标记相比， 特点主要表现在：它结合了 自的优点，方便快速。只需要极少量 料，不需要 交，不需要预先知道 顺序信息，试验结果稳定可靠，可以快速获得大量的信息。而且再现性高，重复性好，因而非常适合于品种指纹图谱的绘制，遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。在一些多态性很少，而且待测样品较少的情况下 (如近等基因系和 析 )， 用 析能达到满意的结果。高密度基因图谱的绘制或对某个基因所在区域的精细作图， 较为理想的方法。 术目前不仅在小麦、水稻、玉米、大豆、棉花等主要作物上得以应用，而且在蔬菜 (马 铃薯、番茄、鹰嘴豆等 )、林木 (垂枝桦、辐射松 )以及拟南芥上广泛应用 (翁跃进， 1996)。以上多数作物的研究结果均表明产生的多态性远远超过了 ，目前被认为是 纹图谱技术中多态性最为丰富的一项技术。但是， 术流程长、难度较大，对操作人员的技术水平要求高，在一般实验室开展此项技术尚存在一定困难。 第一章 前 言 6 记的技术原理 特征性片段扩增区域 ， 技术首次由 et 1993)。该 标记是利用基因组已知序列设计一对特异性扩增引物 ， 对基因组可重复的限定区域高特异性的扩增 ， 并以此来作为基因组特定的标记。这种高特异性的标记克服了 从而为最终实现对生性状相关基因定位、遗传图谱构建 ， 并为优良多基因聚合分子标记辅助选择 (种奠定了试验基础 (et 1999)。此外 ， 记可作为物理图谱的锚定点 ， 对于最终图位克隆 ， 分离该基因时可作为 染色体步查 (探针 ， 以便该基因的分离。 以利于最终克隆该基因 ， 开拓对生新的研究方向以及转基因育种研究。它是通过对多态性 计一对新的引物特异性地扩增一个在特定位点的 般在原引物的两端延伸 14个碱基，利用两端 24个碱基的引物进行特异扩增。该方法具有如下特点：由于使用较长的引物和高退火温度，因此具有高稳定性。有可以将显性 如果是显性标记，则在检 测中可以直接染色，而不需进行电泳检测。由于上述优点， 用一对互补到专一基因组位点的长引物和严格的 件 ， 得到了可靠的可重复的带 ， 它们对反应条件不敏感 ； 对于构建遗传图谱而言共显性的 记比