【毕业学位论文】（Word原稿）莱克多巴胺酶联免疫吸附法（ELISA）的建立动物营养与饲料科学硕士论文

密级： 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 莱克多巴胺酶联免疫吸附法 （ 建立 I 缩略词表 抗体 抗原 碱性磷酸酶 牛血清白蛋白 牛血清白蛋白莱克多巴胺偶联物 s 弗氏完全佐剂 二甲基亚砜 N, N, 酶联免疫吸附分析法 N - 13-（ 3 碳二亚胺（水溶性碳二亚胺） S 气质联用 辣根过氧化物酶 高效液相色谱法 s 弗氏不完全佐剂 免疫球蛋白 G 免疫亲和层析法 钥孔铜蓝蛋白 钥孔铜蓝蛋白莱克多巴胺偶联物 液相层析法 S 液质联用 M 摩尔 /升 质谱法 核磁共振波谱 邻苯二胺 光密度值 磷酸盐缓冲液 酶标板洗涤液 聚乙二醇 莱克多巴胺 3,3,5,5 四甲基联苯胺 要 2 肾上腺素受体激动剂作为药物治疗哮喘已经有 30 年了。不幸的是这类药物被非法用来作为家畜的生长促进剂，用以改善营养物质在脂肪和肌肉之间的重分配，增加瘦肉。这种非法应用对 食用残留有此类药物畜产品的消费者产生了毒害作用。莱克多巴胺是 2 肾上腺素受体激动剂家族中的一员，除了美国等少数国家允许其在合理的范围内作为猪饲料添加剂使用外 ,大多数国家（如欧盟和我国）都禁止其作为生长促进剂使用 。然而，在我国，受经济利益的驱使，许多不法企业和生产厂商利用此药物的危害还没有受到人们重视之际，进行非法添加，这给人民的身体健康和生命安全造成潜在的危害。因此，必须建立快速、灵敏、有效的检测方法。 目前，莱克多巴胺的检测方法主要有：色谱法，毛细管电泳法，免疫传感器法， 酶联免疫吸附测定法（ 。由于色谱法、毛细管电泳法所需的仪器设备昂贵，样品前处理复杂，一次检测样品量少，检测时间长，不易普及等缺点，因而，只作为实验室的确证方法。 酶联免疫吸附测定法（ 克服了以上缺点，作为快速筛选方法 ,得到广泛的应用。目前此种方法在国外已有报道，并且已有商品试剂盒出售，但价格昂贵。我国还没有相关的报道。为了改变国外在此方面的垄断，降低检测成本，必须建立有自主知识产权的产品，因而在 948项目的资助下，本实验旨在建立莱克多巴胺 法。 莱克多巴胺分子量仅为 340，属小分子半抗原（ 本身 没有免疫原性，必须与大分子载体蛋白偶联后才成为完全抗原或包被抗原，载体蛋白质一般用 本论文用多元酸酐法和混合酸酐法相结合将盐酸莱克多巴胺与载体蛋白偶联合成了人工抗原。偶联分两步：第一步用戊二酸酐活化莱克多巴胺成莱克多巴胺 二步用混合酸酐法将其与 联，通过控制载体蛋白的浓度，合成了不同偶联比的免疫原和包被抗原。经核磁共振法和紫外吸收法鉴定，偶联成功，用紫外吸收法测定了偶联比。用免疫原免疫兔子获得了多克隆抗体，间接 测效价，以两倍的阴性血 清 的阳性血清的稀释度为效价，达到 6000 以上。间接抑制 测抗血清的特异性，其 0ng/克仑特罗，沙丁胺醇，特布他林无交叉反应。 制作了标准曲线。 间接抑制 测限为 0.9 ng/性范围为 25 ng/收率为 114.%，变异系数为 直接竞争 测限为 1 ng/性范围为1 17.5 ng/收率为 变异系数为 对 量做了评价，符合检测要求。 与国外产品有差距，需进一步改善。 文中对抗原合成影响因素，特异性响因素进行了较为详细的讨论，并受育种学中奶牛体型参数与产奶相关性中得到启发，提出了免疫动物体型参数与免疫反应性的相关性设想。 关键词： 莱克多巴胺 偶联 半抗原 - as in 0 to of by of to of is a of - a a of u in of as as in in of in by of is a of C,C/C/MS so be is SA to In to LH to to to MR V in 0 ng/ml t of of its 14.%V% of of its V% of in . In of of of of 录 第一章 序 言 . 1 研究背景 . 1 2. 1 半抗原免疫检测 . 3 小分子有机物半抗原免疫分析发展史 . 3 酶联免疫吸附法（ 本原理 . 3 人工抗原偶联方法 . 4 小分子半抗原免疫检测影响因素 . 5 莱克多巴胺 性质 . 9 莱克多巴胺残留检测研究进展 . 10 样品前处理 . 11 莱克多巴胺色谱法检测 . 12 免疫分析法 (. 12 本研究内容、目的、意义 . 15 第二章 莱克多巴胺偶联物制备与鉴定 . 16 实验材料与设备 . 16 试剂及配制 . 16 主要仪器设备 . 17 试验方法 . 17 工抗原制备 . 17 莱克多巴胺与辣根过氧化物酶偶联 . 18 莱克多巴胺与 联 . 18 工抗原偶联鉴定与偶联比计算 . 19 酶标记抗原鉴定 . 20 亲和层析介质 联鉴定 . 20 亲和层析介质 联量 . 20 免疫鉴定 . 21 结果与分析 . 21 人工抗原偶联实验现象 . 21 人工抗原 偶联鉴定结果与偶联比计算 . 21 酶标记抗原紫外鉴定 . 26 联鉴定结果 . 26 联量 . 26 讨论 . 28 偶联原理 . 28 偶联鉴定 . 29 控制偶联比 . 30 影响人工抗原偶联的因素 . 30 酶标抗原偶联 . 31 亲和层析介质偶联 . 32 小结 . 32 V 第三章 莱克多巴胺多克隆抗体的制备 . 33 材料 . 33 试剂及配制 . 33 免疫动物 . 34 仪器与材料 . 34 方法 . 34 两种抗原采用常量长程免疫法制备抗血清 . 34 不同偶联比免疫原微量短程免疫法制备抗血清 . 35 结果与分析 . 36 两种抗原采用常量长程免疫法制备抗血清 . 36 不同偶联比免疫原微量短程免疫法制备抗血清的检测 . 38 讨论 . 43 原理 . 43 影响抗体特异性因素 . 43 小结 . 45 第四章 莱克多巴胺 的建立 . 46 试剂配制 . 46 方法步骤 . 46 抗体提纯 . 46 间接竞争 的建立 . 47 直接竞争 的建立 . 48 结果与分析 . 49 亲和层析结果 . 49 间接竞争 标准曲线 . 50 直接竞争 . 51 讨论 . 53 间接抑制 直接竞争 缺点 比较 . 53 免疫亲和柱层析 . 54 酶标抗原 . 54 响因素 . 54 小结 . 55 第五章 莱克多巴胺竞争 质量评价 . 56 材料与试剂 . 56 仪器 . 56 两种测量方法 . 56 溶液配制 . 56 样品预处理 . 57 添加样品制备 . 57 方法步骤 . 57 的操作步骤 . 57 B 操作步骤 . 57 与 测定结果精密度比较 . 57 与 样品添加回收比较 . 58 与 重复性比较 . 58 结果与分析 . 59 精密度比较 . 59 、 样品添加回收比较 . 60 重复性实验 . 61 讨论 . 61 小结 . 62 结 论 . 63 参考文献 . 64 致 谢 . 76 作者简介 . 77 附录： 合物的核磁共振氢谱 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序 言 1 第一章 序 言 研究背景 近 年来， 由食品引起的中毒伤亡事件屡见不鲜， 全球食品安全问题已成为媒体和公众普遍关注的首要问题 ，引起了全世界高度重视。 饲料是动物食品， 它不仅是营养物质载体，同时也是各种药物载体。 饲料中某些非营养性添加剂直接影响着动物安全和畜产品质量，并通过食物链进而影响着人类健康和生命安全，许多食品安全问题追根溯源是由饲料安全引起的。比如上世纪 80 年代末陆续发生的“瘦肉精”事件就是由于“瘦肉精”添加于饲料，残留于动物体内，人食用残留有“瘦肉精”的动物食品而引起中毒。这曾一度引起世界人民的恐慌。从这个角度来看，饲料安全即食品安 全（杨曙明，2003）。 因此，饲料安全问题受到了世界各国政府高度重视。 我国政府也出台了一系列法律、法规加强饲料安全监管，并着手建立饲料质量监测体系（甘肃省农牧厅， 2002）。 饲料检测也从早期单纯营养成分检测发展为营养成分检测与安全检测并重，甚至安全检测有超过营养成分检测之趋势。近几年，饲料安全检测技术得到长足发展，并成为饲料科学新的研究方向。饲料检测技术集化学、物理、生物学、医学、材料科学、微电子学于一体，已成为多学科交叉的前沿科学。饲料安全检测技术方兴未艾，有开辟一新领域之趋势。 “瘦肉精”即克仑特罗， 2 肾上腺素受体激动剂类药物。此类药物用于治疗呼吸系统疾病已经有 30 年了。不幸的是这类药物被非法用来作为家畜的生长促进剂添加于饲料，用以改变营养物质在脂肪和肌肉之间的重分配，增加瘦肉。由于非法应用，食用残留有此类药物畜产品的消费者产生了毒害作用。莱克多巴胺也是 2 肾上腺素受体激动剂家族中的一员，属违禁药物 ，目前在我国，作为 克仑特罗的替代品 非法添加比较严重，这给人民的身体健康和生命安全造成潜在的危害。因此，必须尽快建立检测方法，打击非法应用，保障人民健康和生命安全。 2 述 2动 剂的结构、作用与肾上腺素和去甲肾上腺素相似，有三个活性基团组成：芳香环， 些基团形成的特异性结构构成了与 前人工合成此类药物有 20种之多， 分为苯胺类、苯酚类和双苯烷胺类（ 998） 。这些药物的作用机理是与 组织细胞如血管平滑肌、细支气管平滑肌的 2受体结合，激活细胞膜上的腺苷酸环化酶，引起细胞产生一系列变化，导致气管、支气管平滑肌松弛，骨骼肌收缩，血管平滑肌松弛中国农业科学院硕士学位论文 第一章 序 言 2 过敏介质释放减少，并增加呼吸道纤毛运动，促进痰液排出 (方炳虎等 1997)，因此 ，最初用来治疗呼吸系统疾病。由于其对心肌，气管平滑肌和血管平滑肌有上述作用，因此若过量使用，必将对人和动物的健康产生影响，如心跳加快和呼吸困难等症状。 自上世纪 80年代初期以来，人们发现其添加于饲料中可提高 胴体瘦肉率和促进生长，因而 作为生长促进剂、营养重