【毕业学位论文】（Word原稿）木质素合成调控及其与甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性关系研究作物遗传育种博士论文

密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 博士 学位论文 木质素合成调控及其与甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性 关系 研究 on on 摘 要 菌核病和倒伏是影 响我国油菜生产的两个重要因素，不仅严重降低了油菜的产量，同时也影响了菜籽的品质和收获指数。在生产中这两个因素又表现出相互促进的作用，因而给油菜生产带来了更大的危害。栽培措施的改进和化学农药的 使 用虽然可以缓减这些因素的影响，但效果有限，且化学农药还会造成环境污染。传统育种和转 丁质酶基因、 3由于缺乏有效的抗源材料，油菜抗菌核病育种一直未取得实质性进展。而国内外对作物抗倒伏性研究也仅处于描述性研究阶段。因此，探索新的方法以提高油菜及其 它作物的抗病性和抗倒伏性具有重要的意义。 木质素作为植物机械组织和细胞壁的重要组成部分，对于增强植物 抵御 各种逆境（风、雨、病原菌）的能力具有重要的作用。在木质素生物合成途径中， 44oA 4于 代谢 分支点的位置，引导 着光合 代谢产物向木质素合成途径的流动 ，被认为是调控木质素合成的理想靶基因。本文首先分析了不同油菜材料木质素含量及其与油菜抗菌核病和抗倒伏性之间的相关关系，为利用基因工程技术提高油菜木质素含量，增强其抗菌核病和抗倒伏能力提供依 据。利用同源序列法 从 毛白杨 中分离 4因，并对其生化功能进行验证 ， 进而通过异源 4的过量表达，研究 4油菜高产、优质、抗逆育种奠定基础，并为作物抗病和抗倒伏研究及育种提供新的思路和方法。本文的另一个研究内容是选用特异抗 菌核病、抗倒伏和特异不抗 菌核 病、不抗倒伏的 油菜 材料配制杂交组合，利用共显性标记 记对甘蓝型油菜抗菌核病和抗倒伏性进行 位研究， 筛 选对油菜抗菌核病和抗倒伏性状具有显著作用的 点， 为下一步 分离和基因聚合创造条件。本研究获得主要如下结果： 1. 分析了 29 个油菜 材料 茎杆木质素含量与抗菌核病和茎杆强度之间的相关关系，其相关系数分别为 明木质素含量与油菜抗菌核病和抗倒伏之间存在显著正相关性。 2. 从毛白杨木质化茎中分离了 一个 4列分析表明，该 推导氨基酸序列分析表明，该 的两个特征序列 进化分析表明，该蛋白为 4 在 进化上与白杨（ 参与木质素合成的 4为相近。 3. 构建了原核表达载体 用 达了含 6）标签的 4性分析表明，所表达的重组蛋白具有生物学活性，能够催化参与木质素合成的三种底物 活化，底物偏爱性顺序为 组蛋白 对 4. 利用 和柱纯化了带 6标签的 4组蛋白，以纯化蛋白作为抗原，制备 4血清，为下一步转基因植株的 5. 构建了植物表达载体 转化甘蓝型油菜品种中双 9号和 37301，共获得 56 棵抗 基因植株，其中 51 株来自 37301，包括转 株 12 棵和转II 株 39 棵。由中双 9 号获得的抗 株共 5 棵，包括转 株 2棵， 转 棵。 6. 0%左右， 析表明，外源基因已整合到油菜基因组中。 7. 测表明，在部分转基因植株中外源基因获得表达。与对照相比，转基因植株的木质素含量、抗菌核病和抗倒伏能力均明显提高。同时也有少数植株表现出基因沉默现象。 8. 构建了中双 9 号 37301 的 3群体，利用 记进行遗传作图，得到一张包含22个 连锁群的遗传图谱 ， 图谱总长度为 记间平均距离为 9. 对甘蓝型油菜菌核病抗性进行 位分析（由于大风未获得抗倒伏性结果）。 在荆州点筛选到 3个与抗病性有关的 分别定位 在 第 4、 15、 21连锁群上，共解释 表型变异。在新洲 点检测到 4个 分别 定位在第 3、 13、 15、 21 连锁群上，共解释 表型变异。 两地共同检测到的 它们 共 解释的变异方差 分别为 荆州点 ） 和 新洲 点） 。 关键词： 木质素 ， 4核病，倒伏， 甘蓝型油菜of in by a at a as be to on by to by an or 3 of of of it is in So it is of a to a of of As an of a in as at a in 4is as an In we of of . of of by of A 4by of of of . we of on S to a . to a of of In of we an a a SR it to be of in as 1. 9 B. . 2. A 4NA a of （ （ . V of is in 3. A a 4a 6 at . A, CA A, a AA. no A. 4. 4a 6 by as 4be to of in 5. o. 9 7301. A 6 an 51 2 CL 9 CL 7301; 5 CL CL o. 9. 6. CR of 0%. of . 7. in of in . in of 8. A o. 9 7301. A 2 SR of 235.3 9. . of to be on , 15, 21 to to on , 13, 15, 21 of in in of 4oA 目 录 第一章 前言 . 1 菜抗菌核病研究进展 . 1 核病的致病方式 . 1 物的抗病机制 . 2 物抗菌核病育种 . 3 物抗倒伏研究进展 . 5 质素合成及其调控研究进展 . 7 质素的类型与分布 . 7 质素的生物合成 . 8 质素合成的分子调控 . 11 质素与作物抗病和抗倒伏性的关系 . 14 4究进展 . 15 组成、结构及酶学研究 . 15 植物基因工程中的应用 . 17 子标记技术及油菜重要农艺性状 . 18 子标记技术 . 18 量性状基因座（ 析 . 19 菜重要性状基因定位研究 . 22 菜 . 24 研究的目的与意义 . 26 第二章 木质 素含量与油菜抗菌核病和抗倒伏性相关关系分析 . 28 料与方法 . 28 料 . 28 法 . 28 果与分析 . 29 论 . 31 第三章 毛白杨 4. 32 料与方法 . 32 料 . 32 法 . 33 果与分析 . 36 扩增 及序列分析 . 36 化分析 . 37 论 . 38 四章 4性分析和多克隆抗体制备 . 40 核表达载体的构建 . 40 料 . 40 法 . 40 的表达 . 41 料 . 41 法 . 41 . 43 料 . 43 法 . 43 . 44 料 . 44 法 . 44 果与分析 . 46 核表达载体的构建 . 46 因在 的诱导表达 . 47 组蛋白活性分析 . 48 克隆抗体的制备 . 48 论 . 49 第五章 4. 51 物表达载体 构建 . 51 料 . 51 法 . 51 蓝型油菜的转化 . 53 料 . 53 法 . 54 基因油菜的分子生物学 鉴定 . 56 料 . 56 法 . 56 基因油菜木质素含量及抗菌核病和茎杆强度的测定 . 59 料 . 59 法 . 59 果与分析 . 60 4. 60 物表达载体 . 61 蓝型油菜的转化 及 . 62 基因油菜 . 63 转基因油菜 . 64 基因油菜 . 65 基因油菜木质素含量分 析 . 65 基因油菜抗菌核病和茎杆强度的测定 . 65 论 . 67 第 六 章 甘蓝型油菜 抗菌核病 . 70 料与方法 . 70 料 . 70 法 . 71 果与分析 . 72 2： 3群体的构建 . 72 本多态性检测 . 72 . 72 锁遗传图谱的构建 . 73 菜菌核病 抗性在 . 73 菜 抗菌核病的 位及其效应分析 . 75 论 . 75 第 七 章 讨论 与总结 . 78 论 . 78 质素在油菜抗菌核病和抗倒伏机制中的作用 . 78 质素 的 合成调控 . 79 节 . 81 参考文献 . 82 附录 . 99 致谢 . 101 作者简历 . 102 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 性效应 苄青霉素 硫酸铵 酰丁香酮 6 643吲哚磷酸盐 基对 血清蛋白 5S 草花叶病毒 35 苄青霉素 六烷基三甲基溴化胺 培品种 2,4 2,4， 4性效应 碳酸二乙酯 ,4 敏反应 丙基硫代 莉 酸 那霉素 道尔顿 -M e 2-(-(乙磺酸 续上表） 蓝四唑 酸 密度值 酸氧化酶 丙烯酰胺凝胶电泳 铃薯葡萄糖琼脂（培养基） 量性状位点 利福平 杨酸 日葵糖氧化酶 二烷基硫酸钠 关序列扩增多态性 单重复序列 酸链霉素 ,N,N,N,N,移 P 种抗真菌蛋白 543吲哚 中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前 言 油 菜作为一种重要的油料作物， 在我国和世界 油用作物中 均占有重要的地位 。全世界每年生产的食用 植物 油中，其 中有 15%来自油菜（ 991） ， 而在我国这个数字 则 达到50%左右 （李加纳 等 ， 2004）。油菜在世界范围内如欧洲 、 加拿大 、 中国、 印度等地 均有 广泛种植 。但 从种植面积和 总产量 来 看 ，我国 的 油菜 生产 均位居世界首位，两项各约占世界的 1/3（ 002,7:8） 。 尽管如此， 由于人口的增长 和 经济的快速发展， 对 植物油的需求一直呈现上升趋势，食用油的供需矛盾 也 日益突出 ， 为此国家不得不每年从国外进口大量的油脂和油料，进口总量居世界首位。 即便如此 ， 目前我国人均食用油的占有量仍不到世界平均水平的 70%，与发达国家相比差距则更大 。另一方面，由于 地球上 化石燃料（石油、煤炭）的 逐渐 枯竭， 整个世界将面对日益严峻的能源 短缺 问题 ， 而 植物 油脂 作为一种可 再生的替代能源， 可 在一定程度上 缓减这一趋势 （王汉中， 2005） 。 因此 大力发展油菜生产，进一步提高油菜 的 产量和品质对于 人民生活水平的 提高、 缓减能源短缺 具有重要的现实意义。 油菜作为我国最主要的油料作物之一 ， 自二十世纪八十年代以来，随着杂交油菜和双低油菜品种的选育成功及在生产上的大面积推广，油菜的产量和品质都得到了较大幅度 的提升。但 生产中 的一些 限制 因素如病害、 虫害、 倒伏等问题 影响 了油菜增产潜力的发挥 ， 特别是菌核病的危害，严重降低了油菜的产量和品质，一般年份可使油菜减产 15严重的年份可达 50右 （ 李方球等， 2001） ，并导致含油量降低 1梁长城等， 2002） 。因此菌核病 是 影响 我国油菜生产的主要因子之一。尽管化学农药的使用对菌核病具有 一定的限制作用， 但抗病品种的培育无疑是最有效的方法之一。遗憾的是，由于菌核病 病 菌属于 广谱性非专化病原物，到目前为止，仍没有找到对菌核病免疫的有效抗源， 而 只是在一些品种中表现出 对菌核病一定程度的生理抗性或避逆性（ 王汉中等， 2004； 傅寿仲等， 1992） 。 因此，就现阶段来说， 一方面 应 利用 在油菜 品种 中存在的 部分抗性 进行 抗 菌核 病 育种工作 ； 另一方面， 充分 发掘和 利用 在 其它物种中 广泛 存在的抗性资源 或 因子 ， 以提高油菜的抗菌核病能力 ，也是一 个 较好的策略 。 另外一个影响 油菜产量提高的重要因素 是倒伏问题 。据 1994） 估计 ,每年由于油菜倒伏所引起产量损失可达 16%； 同时油菜倒伏 降低了 油脂 的品质 和收获指数， 增加了油菜的生产成本（李云昌 等 ， 2004） ；更为严重的是，倒伏造成了田间小气候的变化 （光照的减弱和湿度的增加） ， 加重了许多病害的发生 （ H S, et 1999; S, et 003） 。 因此深入研究油菜的抗菌核病和抗倒伏机制 ，培育 新的抗病和抗倒伏品种 对于稳定和提高油菜 的 产量 和品质 具有重 要的意 义。 菜抗菌核病研究 进展 核病的致病方式 通常侵染植物的病原 菌 主要有 真菌、细菌、病毒等几类 。其中 病毒一般通过机械擦伤、昆虫中国农业科学院博士学位论文 第一章 前言 2 介导进入寄主细胞，然后经胞间连丝进入周围细胞， 再 经 维管束运往寄主全身；细菌一般通过伤口、气孔、皮孔等进入 寄主细胞 的 间隙和导管；而真菌则是 直接通过菌丝插入寄主表皮细胞，或通过伤口、气孔等进入寄主细胞间隙和导管，并进一步侵入周围细胞 (余叔文等， 1998)。病原菌对寄主植物的侵染不同 于 一般的物理和化学逆境，它是一个主动的过程，即 通过本身 分泌的酶、毒素来达到侵染的目的。一般来说，病原菌的致病手段主要有以下几种方式：分泌破坏寄主细胞的酶类如角质酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素 酶、磷脂酶、蛋白酶等水解酶，使寄主发生