【毕业学位论文】（Word原稿）高粱幼苗水分胁迫诱导表达差异cDNA的研究作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 高粱幼苗水分胁迫诱导表达差 异 研究 on of in of on of I 摘 要 干旱是能够引起植物发生水分胁迫的一种最重要的环境因子，它极大限度地制约着植物生长和作物产量。改善和提高植物的抗旱性研究是植物抗逆性研究的重要内容。随着分子生物学技术的发展，通过基因工程改良植物的抗旱能力被广大科研工作者认为是一种快捷、有效的方法。 差异显示反转录聚合酶链式反应，简称 其操作简单、快速、灵敏性高、易重复等优点，自 1992 年由 明以来，已成为分子生物学领域一种强有力的工具，被广泛地用来分离差异表达的基因。 在当前的研究中，我们采用了 异显示技术和银染技术，对经过用 =液处理不同时间而诱导表达的高粱基因进行分离，共得到差异表达的 段 53条。方法是：用 = 液来处理高粱幼苗，用去离子水培育幼苗做对照，提取的总 反转录后进 行 增，扩增的 物最后经 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染染色后可观察到清晰的条带。所回收的 53 条差异带，其中 包括 6 个完全诱导表达片段， 42 个上调 表达 片段和 5 个下调表达片段。 经 到阳性表达的 段 13 个。当用单个随机引物对上述 13 个片段进行再次扩增时，全部表现为阴性。得到的 13 个阳性 段克隆并测序，通过与 的 据库比对，结果发现， 10个 段与已知序列有较高的同源性， 3 个为未知基因序列。其中，受水分胁迫处理诱导 表达信号增强的 段 隆同源性 100%，与氧化胁迫的二色高粱叶片和根 隆同源性 100%，与酸碱处理的二色高粱根 隆同源性100%，与水杨酸处理的二色高粱苗期 隆同源性 100%； 氧化胁迫的二色高粱叶片和根 隆同源性 100%； 缺乏和盐胁迫诱导的二色高粱苗期 隆同源性 100%。 另外 7 个受水分胁迫处理诱导表达的 段序列 与水杨酸处理的二色高粱苗期 伤的二色高粱叶 片 化胁迫的二色高粱叶片和根 碱处理的二色高粱根 胁迫诱导的二色高粱苗期 旱胁迫诱导的二色高粱开花前 旱胁迫诱导的二色高粱开花后 色高粱光生长 缺乏诱导的二色高粱苗期 源性 高达 95%以上。另外 3 个差异片段与已知序列同源性非常低，推测可能为新的基因序列，其序列全长及其功能鉴定有待于进一步的工作。 关键词：高粱，水分胁迫，克隆，差异显示， is of Its an of on to or of in of a of to on of of to a in of 992 is In we to 3 000, = as in as of CR % by A 3 by 42 5 to be by of in T ST we of Of 00% to 00% 00% 5% to ST it be a is to do 录 摘 要 . 录 .一章 引言 .究目的和意义 .物抗旱性研究概况 . 作物的抗旱性及其生理机制 . 作物抗旱性的分子生物学基础 . 4 旱诱导的基因表达与调控 . 干旱诱导的基因表达 . 5 旱诱导基因表达的调节 . 6 物基因的克隆技术 . 功能性克隆 . 7 型克隆 . 7 位克隆 . 9 座子标签技术 . 9 子克隆 . 10 1.5 异显示技术及其研究进展 . 异显示技术的原理 . 11 异显示技术的应用 . 11 异显示技术的优缺点 . 18 异显示技术的改进 . 18 第二 章 材料与方法 . 21 料 . 21 物材料 . 21 要试剂与引物 . 21 验方法 . 幼苗总 提取和 检测 . 22 转录 . 22 增 . 23 胶电泳检测 . 23 异片段的回收、二次扩增及单引物阴性对照实验 . 24 . 24 异片段克隆 测序及同源性比较 . 26 第三章 结果与分析 . 31 粱幼苗的水分胁迫处 . 检测结果 .异显示 .4 异片段回收后二次扩增及单引物阴性对照实验检测结果 .果 .6 异片段的克隆 .组质粒的鉴定及测序 . 质粒的提取 . 34 组质粒的菌液 定 . 35 序 .交检测结果 .序结果在 .四章 讨 论 . 40 理及 .2 异显示 .次扩增结果 .交 .物对水分胁迫的响应机制 .五章 结 论 . 43 参考文献 . 44 致 谢 . 52 附：试剂的配制 . 53 缩 略 词 .者简历 . 第一章 引 言 1 第一章 引 言 究目的和意义 水是人类赖以生存的物质基础，也是植物生长的先决条件。植物的各种生理代谢过程都是在水分参与下完成的。尽管地球表面的 70%被水覆盖，但是在地球总储水量中只有 淡水。这些淡水资源不仅分布极不均匀，而且还有相当一部分无法被人们利用。另一方面，全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的 36%，占耕地面积的 43%。如前苏联、美国、加拿大、澳大利亚等国家播种面积的 70%位于干旱、半干旱地区，其余耕地也常因遇到周期性或难以预料的干旱而导致农作物减产（汤章城， 1983）。据统计，世界各地因不同程度的干 旱所导致的小麦减产每年约在 30%左右（ et 1992）。因此世界各国对干旱条件下作物的生长给予了很大关注。 我国是世界人口第一大国，预计到 2030 年人口将高达 16 亿，处于历史上承载最大人口数量的关键时期，因此保障粮食安全对于正在发展中的国家经济尤为重要。同世界其他国家相比，由于自然条件的限制和社会经济发展的巨大需求等原因，我国农业可持续发展面临着严重的水资源危机（景蕊莲， 1999）。我国大部分地区属于中纬度干旱半干旱气候类型，而干旱、半干旱地区主要分布在华北、西北、内蒙和青藏高原等地区，约 占全国土地总面积的 50%（张林刚等， 2000）。同时全国受旱面积还在不断扩大，有数据表明 20 世纪 50 年代全国平均受旱面积为 1133 万公顷，80 年代为 2333 万公顷，而 90 年代则增加到 2667 万公顷。因缺水而导致的粮食损失在 700蕊莲， 1999）。随着社会经济的不断发展和全球气候的变化，水资源不足的形势日益严峻，今后出现持续干旱的形势不可低估。因此，除了贯彻好宏观上的节水农业、优化生态环境、节约及合理利用水资源外，培育抗旱、耐旱作物新品种成为抵御干旱最为经济、安全和有效的措施之一，对我国及世 界粮食产量的稳定具有极其重要的意义。 植物的抗旱性是指植物在干旱条件下的生存能力，而作物的抗旱性是指在土壤干旱或大气干旱条件下作物不仅能存活下来，而且能使产量保持在一定水平的能力（黎裕， 1999）。干旱胁迫常常影响作物生长发育，造成作物严重减产。作物的产量是作物遗传基因在特定环境下表达的产物，其实际产量与生产潜力相差较多的原因是不良环境的危害，其中干旱是很重要的因素之一（袁宝玉， 1998）。传统农业中，通常采用常规方法选育抗旱品种，但是常规方法选育抗旱品种不仅费时、费力，而且不能满足农业生产对抗旱节水新品种 的需求。近年来，随着分子生物学研究的不断深入和生物技术的迅猛发展，利用基因工程技术结合传统育种方法来培育高产、稳产、耐旱、耐盐、抗病等优良性状的作物新品种已成为研究热点之一。 高粱被人们称为“生命之谷”、“救命之谷”，是人类栽培的重要谷物之一，全世界五大洲、48 个国家和地区都有种植，年种植面积大约为 4400 万 次于小麦、水稻、玉米，列第四位。研究表明，高粱的蒸腾系数为 250300，比水稻（ 400800）、小麦（ 270600）和玉米（ 250450）小；高粱凋萎系数为 于玉米（ 小麦（ 因此，在干旱、半干旱地区发展高粱生产，有利于缓解水资源短缺的矛盾。目前，随着人民生活水平的提高，高粱在粮食作物中的重要地位有所下降，但其所具有的许多优良性状和综合利用价值是其它作物无法替代的。在我国干旱、半干旱、低洼易涝、土壤瘠薄的地区，高粱可作为种植业结构调整的重要粮食作物、出口创汇的优势作物或适应当地气候条件的特色作物，在促进农村经济增长，增加农民收入等方面起到中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 2 愈来愈重要的作用。这是因为高粱植株的各部分均有潜在的利用价值。例如，高粱籽粒和茎叶均可做为畜、禽、鸟、鱼的饲料，还可酿造白酒、酒 精、醋等。高粱籽粒可制糖、加工成淀粉或麦芽制品；高粱壳可提取色素，并且无任何毒副作用，可广泛应用于食品添加剂、化妆品等行业，茎秆可制作板材，髓可加工成食用纤维，高粱蜡粉可加工成蜡质，具有耐高温特性，等等（马尚耀等， 2002）。 随着工农业的发展，耕地面积逐渐减少，自然灾害发生频率增加，高粱作为减灾作物将在国民经济发展中起着重要的作用。高粱具有抗逆性强的特性，既抗旱、耐涝，又耐盐碱、耐瘠薄。因此，本研究以高粱作为材料，研究抗旱相关基因的表达，旨在为从分子水平上认识植物抗旱机理，发掘并利用抗旱基因奠定基础。 物抗旱性研究概况 物的抗旱性及其生理机制 物的抗旱性 作物的抗旱性可定义为作物物种或品种在蒙受周期性水分亏缺的地区能正常生长、结实的能力。从生物学上讲，植物在干旱条件下存活并不一定和最高产量有联系。在水分匮乏的环境里，植物常常通过部分或完全保护生命的方式，即减少叶面积、抑制代谢作用等继续存活，这类存活机制往往与降低产量潜力有关。作物品种资源中，在干旱条件下存活能力强的基因型其农艺性状往往较差、产量较低，难以直接利用，这就赋予抗旱育种工作者以艰巨的任务，要将抗旱性和丰产 性统一于一体，选育抗旱丰产的品种。 作物的抗旱性可以划分为避旱性、御旱性和耐旱性三类。作物的避旱性定义为在土壤发生严重水分亏缺之前作物完成其生活史的能力，包括迅速的物候发育和发育的可塑性。作物的御旱性也称为高水势下的耐旱性，指干旱条件下作物保持体内充足水分的能力，包括水分损失的限制和水分吸收的维持。作物的耐旱性是指作物忍受低水势和耐脱水的能力，包括两种机理：一种是使植物适应低水势并维持生长、发育及生产的机理；一种是使作物熬过并从严重干旱中恢复过来的机理，即耐干性（山仑等， 2000）。抗旱性虽然是一个很复杂的 问题，但不同基因型间的抗旱性差异是确实存在的（景蕊莲等， 2003）。 物抗旱的生理机制 孔调节 植物对水分亏缺的最初反应是通过减小气孔口径来调节气孔开度，尽可能地减少因蒸腾作用造成的水分散失。气孔的反应方式有两种：一种是对空气湿度的直接反应；另一种是对叶片水势变化的反应。植物组织的水势体现了植物体内水分的能量状态，可与土壤和大气中的水分联系起来，直接决定着植物对水分的吸收、运输和散失过程。现在人们已经知道叶片气孔的关闭是由根系在干旱胁迫下产生的 过导管输送到叶片 的气孔上实现的。由此，可以通过转基因技术中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 3 将编码 物合成关键酶的基因导入植物基因组中，使作物在干旱胁迫条件下产生更多的而引起气孔的关闭进而达到抗旱的目的。当然气孔关闭会影响光合作用的效率，进而影响作物的生长。因此必须协调好两者之间的关系，使作物既具有一定的抗旱性，同时又有较好的生长势。 透调节 在受到轻度干旱胁迫时，作物能够通过渗透调节降低水势，保持膨压。作物的渗透调节主要通过积累渗透调节物质来实现。 朱志华 等（ 1995）研究认为小麦品种渗透调节能力与抗旱性呈显著正相关，不 同生育期渗透调节能力不同，灌浆期最高，苗期次之，孕穗期最低。目前已知的渗透调节物质有：蔗糖、甘露醇、脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、海藻糖、果聚糖、肌醇、多胺等小分子化合物（张树珍等， 2001）。此外，离子和水分通道的变化调节着离子和水分进出细胞，也是渗透调节的重要方面。如在正常情况下游离脯氨酸含量仅为 g 干重，占总游离氨基酸的百分之几。而在干旱条件下它可成 10 倍地增加，相对量可达到 30%以上。由此通过转基因技术能使作物本身在干旱条件下产生更多的渗透调节保护物质，从而可大大提高作物的抗旱性。甜菜碱 是植物中另一类常见的亲和性渗透物质，广泛存在于高等植物、动物与细菌中。干旱胁迫下，甜菜碱的累积与胆碱加单氧酶（ 甜菜碱醛脱氢酶（ 性的增加密切相关（ et 1989）。此外，渗调蛋白、脱水素、胚胎发育后期丰富蛋白等大分子物质也对渗透调节有一定贡献。 除活性氧 80 年代以来，人们对干旱胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究，发现植物体内存在着一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质，如超氧歧化酶（ 过氧化物酶（ 过氧化氢酶（ 抗坏血酸（ 。它们协同抵抗干旱胁迫造成的氧化伤害，但是，单一的抗氧化酶或抗氧化物不足以完全防御这种氧化胁迫。如 化两个超氧自由基发生歧化反应形成 2 化。在整个氧化防御系统中， 所有植物在氧化胁迫中起重要作用的抗氧化酶。根据其结合金属离子的不同， 分为 种类型。 要存在于叶绿体和细胞质中， 要存在于线粒体中，主要位于叶绿体中。一般来讲，干 旱胁迫条件下植物体内 酶的活性与植物抗氧化胁迫能力呈正相关。抗旱性强的植物，在干旱胁迫下， 活性较高，因而能有效地清除活性氧，抑制膜脂过氧化。 变光合作用途径 白天开放气孔，吸收和同化 白天气温较高、蒸腾强，不利于在干旱条件下保持水分。而景天科代谢（ 径是夜间开放气孔进行 吸收和固定，白天关闭气孔减少蒸腾失水。研究发现某些植物在水分亏缺条件下，可以由 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 4 径转变为 径（张秀海等， 2001）。 白、水通道蛋白和脱水素 白，全称为胚胎发育晚期丰富蛋白（ 是指胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质，最早发现于棉花胚胎发育后期的子叶中（ et 1981）。 白在干旱过程中能对植物起一定的保护作用，使植物能够在水分亏缺时，保持细胞膜系统及生物大分子免受破坏。特别是在极端干旱的情况下，被诱导出的 白对植物所起的保护作用显得更为突出。目前推测 白可能有以下三方面的作用：（ 1）作为脱水保护剂。由于 白在结构上富含不带电荷的亲水氨基酸，它们既可能像脯氨酸一样，通过与细胞内的其它蛋白发生相互作用，使其结构保持稳定，又可能给细胞内的束缚水提供了一个结合衬质，从而使细胞结构在脱水中不致遭受更大的破坏；（ 2） 作为一种调节蛋白而参与植物渗透调节；（ 3） 通过与核酸结合而调节细胞内其它基因的表达。有些 白含有一些带正电荷的保守区域，有人推测这些区域可以同核酸类物质结合。 水通道蛋白是一类膜蛋白，分子量约 26 29类蛋白形成水分运输的特异性通道，能增强细胞膜对水分的通透 性。水通道蛋白属于主要内在蛋白（ 族。所有的 白在结构上均有 6 个跨膜的结构域，其羧基端及氨基端位于细胞质的一侧。水通道蛋白最早发现于哺乳动物的某些特殊的细胞类型中，如红细胞、肾小管细胞等。最近在植物中也发现了多种水通道蛋白，这些水通道蛋白可分为两类：质膜水通道蛋白和液泡水通道蛋白。 近年来，复苏植物成为研究高等植物耐旱机制的热点。 在复苏植物的叶子中发现通常存在于种子发育早期的脱水蛋白，又称脱水素（ 1996）。它是一种广泛存在于高等植物的干旱诱导蛋白，含有一个或数个由 15 个氨基酸组成的富含赖氨酸的保守区，即 类蛋白具有很强的亲水性和热稳定性。赵恢武等（ 2000）根据已知植物脱水素基因的保守区域设计引物，采用 法从耐旱植物厚叶旋蒴苣薹的总 扩增出一个 500与植物脱水素基因同源的序列。结合 5 得了植物脱水素基因家族的一个新成员 全长 1148 交分析表明， 因在厚叶旋蒴苣薹基因组中以单 拷贝形式存在； 交结果表明该基因的表达受干旱、寒冷及 诱导。由此推断该基因可能与厚叶旋蒴苣薹的耐旱特性有关。 物抗旱性的分子生物学基础 随着生物技术的发展，人们利用分子生物学方法对作物的抗旱性展开了一系列研究。研究表明，作物耐受干旱胁迫的一系列生理生化代谢途径，如水分吸收的维持或增强、光合作用的保护、离子稳态的维持等，都是受多基因控制的，具有数量性状性质。有报道认为， 累、渗透调节、根系形态等变化是受多基因控制的（ et 1996； et 1998； et 1995； et 1996； et 1995），由此可以理解作物抗旱性的数量性状本质。另有报道认为，这些与干旱胁迫诱导相关的基因可能是一些结构基因或调节基因（ 1997；et 1998）。在抗旱相关性状的分子标记方面， 分子标记技中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引 言 5 术越来越多地被用于种质资源和品种的筛选、鉴定，已从不同作物几种性状的数量性状位点（ 图研究中获取大量信息，也鉴定出一些编码具有潜在功能蛋白的干旱诱导表达基因，例如水稻、豌豆、西红柿及模式植物拟南芥等（ et 1999）。 旱诱导的基因表达与调控 旱诱导的基因表达 现已分离出许多干旱诱导基因，对此研究较多的有 些基因表达的多肽，有的功能已经清楚（ et 1996）。如从拟南芥中分离的 to to 番茄的 因，常以多基因家族形式存在，可迅速地应答干旱，其中对 因的研究较深入。在拟南芥中分离到的 、 9、 1、 2、 9、 7、 0、 5 和 6基因，它们表达的时间及产物功能皆不同。在干旱处理 ， 1 和 9 开始表达；干旱处理 ， 0 和 开始表达；干旱处理 ， 2、 8 和 7 才开始表达，而 9 却表达 2 次，先在干旱处理 20表达，然后在干旱处理 又开始表达。此外 2 和 9 基因的表达还可被 导，但 能诱导 9、 1 和 8 基因的表达，这表明植物应答干旱胁迫时， 因表达有几个信号途径（ et 1992）。 （ et 1997）从拟南芥中克隆到 40 多个脱水诱导基因，通过对这些脱水诱导基因的表达分析，他们 认为在脱水反应中至少存在 4 条信号转导途径，其中2 条依赖于 2 条不依赖。如 因的诱导可被 节，其启动子为一个 67中 位置在脱水诱导的表达中像是顺式作用元件。 合蛋白 别特异地与 67段中的 置结合。 因的转录可被脱水和 理所诱导，而 因可被 导。因此，这两种蛋白在脱水条件下，可协同执行 因的表达。而不依赖 号途径的基因 的启动子至少包含两个顺式作用元件，一个是在和 关的对脱水处理作出缓慢反应的过程中起作用，另一个是在不需要 与的快速诱导中起作用。 9A 启动子位于 53域内，含有一个和似的序列及类似于激活子 序列，它们在 第二次慢速诱导过程中起作用，而启动子内位于 111之间具有两个 20其中央的 9列（ 名为同向重复 1 或 水分胁迫诱导 达过程中起调节作用的元件。它的缺 失会造成 水分胁迫不应答。 一个新的水分胁迫应答